氨基酸转运载体的研究

氨基酸转运载体的研究
摘要:氨基酸转运载体是介导氨基酸跨膜转运的膜蛋白,在氨基酸营养机体细胞和神经调节过程中起着重要作用;而且,其功能异常会导致严重的氨基酸吸收和代谢障碍性疾病,也具有重要的病理学意义。

本文就近年来关于中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸转运载体家族成员及其组织分布、分子生物学特征、生理功能和病理学意义等研究进展进行了综述。

关键词:氨基酸转运载体;中性氨基酸;酸性氨基酸;碱性氨基酸
早在20世纪60年代,人们就开始通过制备膜泡和培养艾氏(Ｅｈｒｌｉｃｈ)腹水瘤细胞、红细胞等手段陆续发现了Ａ型、Ｌ型和β型等多种氨基酸转运载体[1]。

虽然大多数氨基酸转运系统尚未在分子水平上阐明,但是通过克隆编码特定转运载体蛋白的ｃＤＮＡ,极大地加深了人们对氨基酸转运载体生理功能和病理学意义的了解。

研究表明,氨基酸转运载体既是氨基酸作为营养素从机体胞外进入胞内的通道,也是氨基酸进出胞内完成神经细胞兴奋、抑制等重要细胞功能的通道。

氨基酸转运载体也与胱氨酸尿症、范科尼(Ｆａｎｃｏｎｉ)综合症、哈氏遗传性疾病(Ｈａｒｔｎｕｐｄｉｓｏｒｄｅｒ)和家族性肾原性亚甘氨酸尿症等氨基酸吸收障碍病密切相关[2,3]。

ｃＤＮＡ克隆技术是研究和认识氨基酸转运系统的有效手段,最初用于研究哺乳动物Ｎａ+依赖性高亲和性谷氨酸转运系统,即Ｘ-ＡＧ型酸性氨基酸转运载体[4],并基于与谷氨酸转运蛋白序列相似性,发现了转运丙氨酸、丝氨酸和半胱氨酸的Ｎａ+依赖性转运蛋白,即ＡＳＣ型中性氨基酸转运载体[5]。

最终,发现了中性和酸性氨基酸转运载体家族。

迄今,已经形成了庞大的中性、酸性和碱性氨基酸转运载体家族。

以下就各转运载体系统的研究进展做一综述
1 氨基酸转运载体系统分类
氨基酸转运载体系统一般以其底物分为中性酸性和碱性氨基酸转运载体系统,或者以对Ｎａ+的依赖性分为Ｎａ+依赖性和Ｎａ+非依赖性转运系统(见表1)[3,6]。

Ｎａ+依赖性转运系统利用质膜上以Ｎａ+电化学势梯度形式储存的自由能逆浓度梯度从胞外转运氨基酸底物进入胞内,因此,这些转运载体具有强大的动力从胞外转运氨基酸至胞内[3]。

Ｎａ+依赖性氨基酸转运系统包括Ａ型、Ａ
ＳＣ型、Ｂ0型、ＸＡＧ-型、Ｂ0, +型和β型等转运载体;Ｎａ+非依赖性氨基酸转运系统包括转运中性氨基酸的Ｌ型、转运小型中性氨基酸的ａｓｃ型,选择性转运芳香族氨基酸的Ｔ型、选择性转运碱性氨基酸的ｙ+型,转运碱性和中性氨基酸的ｂ0, +和ｙ+Ｌ型以及转运胱氨酸和谷氨酸的ｘｃ-型[6]等转运载体。

2 中性氨基酸转运载体家族
中性氨基酸转运载体家族成员最多,也是研最多的氨基酸转运家族,包括Ｂ0型、Ａ型、Ｎ型、
ＡＳＣ型、Ｇ型、β型、ｙ+Ｌ型等Ｎａ+依赖性转运载体和Ｌ、ａｓｃ、Ｔ、ｂ0, +等Ｎａ+非依赖性转运载体。

其中以Ｂ0型、Ａ型Ｎ型转运载体研究较多。

2.1 Ｂ0型中性氨基酸转运载体
Ｂ0型转运载体分布在上皮细胞刷状缘膜,主要转运中性氨基酸,具有广泛的底物选择性,在ｐＨ值低于5.5时,还能转运Ｌ-Ｇｌｕ[7]。

Ｂ0型转运载体可分为Ｂ0ＡＴ1和Ｂ0ＡＴ2两个亚型。

Ｂ0ＡＴ1亚型载体的基因首先从小鼠肾脏克隆得到[7],Ｂ0ＡＴ1载体能转运所有的中性氨基酸,特别对亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸等大型脂肪族氨基酸的最大转运效率较高,而对其他亲水性氨基酸的效率则较低,仅为亮氨酸最大转运效率的一半。

原位杂交结果[8]表明,Ｂ0ＡＴ1载体主要在肾脏和肠道表达,在肾脏近曲小管Ｓ1和Ｓ2段外皮层呈高表达,在小鼠空肠和回肠粘膜上皮大量表达,十二指肠表达较少,结肠则不表达。

Ｂ0ＡＴ1主要在肾脏近曲小管和小肠吸收氨基酸,在肾脏近曲小管近端为中性氨基酸低亲和性转运载体,而远端则为高亲和性原位杂交结果[8]表明,Ｂ0ＡＴ1载体主要在肾脏和肠道表达,在肾脏近曲小管Ｓ1和Ｓ2段外皮层呈高表达,在小鼠空肠和回肠粘膜上皮大量表达,十二指肠表达较少,结肠则不表达。

Ｂ0ＡＴ1主要在肾脏近曲小管和小肠吸收氨基酸,在肾脏近曲小管近端为中性氨基酸低亲和性转运载体,而远端则为高亲和转运载体。

Ｙａｍａｓｈｉｔａ等[9]报道了Ｂ0ＡＴ1载体的蛋白质结构,该蛋白具有12个跨膜螺旋区,螺旋区1和6构成了底物转运通道的核心部分,具有多个高度保守的残基,并在螺旋区1和6发现了两个Ｎａ+结合位点,从蛋白质结构上解释了与Ｎａ+协同转运而不与Ｃｌ-协同转运的原因。

Ｂ0型转运载体与哈氏遗传性疾病密切相关,ＳＬＣ6Ａ19基因突变(517Ｇ※Ａ,718Ｃ※Ｔ)引起它编码的Ｂ0ＡＴ1载体的蛋白构象改变或功能区结构改变,使其功能减弱甚至丧失[2],从而导致哈氏遗传性疾病。

据报道[10],在哈氏遗传性疾病病人体内,除了色氨酸外,其他中性氨基酸浓度没有明显变化,说明除了Ｂ0ＡＴ1外,还有其他的中性氨基酸转运载体,但Ｂ0ＡＴ1是色氨酸在小肠唯一的转运载体。

Ｂ0ＡＴ1在大脑中不表达,哈氏遗传性疾病常伴随共济失调和精神病症状,可能是由于缺乏色氨酸和酪氨酸等神经活性氨基酸而造成的[11]。

Ｂ0ＡＴ2蛋白的基因位于12ｑ21,由12个外显子组成,编码730个(人)或729个(小鼠)氨基酸的蛋白质。

Ｂ0ＡＴ2蛋白分布于大脑,主要转运谷氨酸和γ-氨基丁酸(ＧＡＢＡ)等神经递质的底物。

神经细胞自身不能合成谷氨酸和ＧＡＢＡ,必须依赖Ｂ0ＡＴ2从胞外转运。

同样,神经胶质细胞内的谷氨酰胺也是由胞外转运的谷氨酸形成。

Ｂ0ＡＴ2还能转运芳香族氨基酸,芳香族氨酸是合成多巴胺、5-色胺和去甲肾上腺素的底物。

Ｆａｎ等[12]以谷氨酰胺为代表性氨基酸研究了猪肠道Ｂ0型Ｎａ+依赖性和Ｌ型Ｎａ+非依赖性中性氨基酸转运载体的细胞生理特点发现谷氨酰胺主要通过刷状缘Ｂ型和Ｌ型转运载体转运,而且,中性氨基酸之间互相竞争转运载体。

2.2 Ａ型与Ｎ型中性氨基酸转运载体
Ａ型转运载体首先在艾氏腹水癌细胞中发现,主要转运小型中性氨基酸和Ｎ-
甲基氨基酸,如α-(氨甲基)异丁酸(ＭｅＡＩＢ),包括ＡＴＡ1、ＡＴＡ2和ＡＴＡ3三个亚型,主要在胎盘、心脏、大脑和骨骼肌表达,对Ｌｉ+不耐受,对ｐＨ高度敏感[13]。

Ｎ型转运载体首先在大鼠肝细胞中发现,由ＳＮ1和ＳＮ2蛋白组成,属于ＳＬＣ38基因家族,主要参与谷氨酰胺、天冬酰胺和组氨酸的摄入。

Ｋｉｌｂｅｒｇ等[14]研究发现Ｎ型系统与Ａ型系统区别在于其对Ｌｉ+耐受,即Ｎａ+由Ｌｉ+取代时仍具转运活性,表现出明显的ｐＨ值依赖性,ｐＨ值 6.0～6.5时活性很低,而ｐＨ值6.5～8.5时活性增加数倍。

Ａｈｍｅｄ等[15]进一步研究表明,根据不同的功能特征和组织分布Ｎ型转运系统可以分为Ｎｍ和Ｎｂ两个亚型,均主动转运谷氨酰胺,并可能参与其代谢。

Ｎｍ亚型主要分布于骨骼肌中,对Ｌｉ+具有弱的耐受力,对ｐＨ值敏感。

在大脑中存在两种亚型,星形胶质细胞与肝细胞的Ｎ系统相似,但神经细胞的Ｎ系统与肝细胞Ｎ系统和骨骼肌Ｎｍ系统均存在明显区别,被称为Ｎｂ系统,其与Ｎｍ亚型一样,对Ｌｉ+具弱的耐受力,对ｐＨ值敏感,但可被谷氨酸抑制。

2.3 ＩＭＩＮＯ中性氨基酸转运载体
ＩＭＩＮＯ转运载体的基因位于3ｑ21.3,具有11个外显子,人为单一基因,在小鼠和大鼠则为两个同源基因。

在大脑中高表达的称为ＩＭＩＮＯＢ,在肾脏中高表达的称为ＩＭＩＮＯＫ。

ＩＭＩＮＯＫ和ＩＭＩＮＯＢ在肾脏近曲小管均呈高表达,但在小肠和大脑仅有ＩＭＩＮＯＢ表达[11]。

在大脑内ＩＭＩＮＯ转运载体转运脯氨酸进入胞内,脯氨酸作为神经毒素其毒性较大,约为谷氨酸的9倍,在生理条件下,大脑细胞外脯氨酸浓度约为3μｍｏｌ·Ｌ-1,但在Ⅱ型高脯氨酸血症病人大脑胞外脯氨酸浓度则高达30μｍｏｌ·Ｌ-1,表现为精神发育迟滞[11],Ⅰ型高脯氨酸血症病人则表现为精神分裂症,均由脯氨酸代谢失调引起,虽然已知高浓度脯氨酸的致病机制,但是对脯氨酸摄入与排出的调控机制不甚清楚,仅知道脯氨酸经脉络丛排出,但其转运的具体机制尚有待研究。

2.4 其它中性氨基酸转运载体
ＡＳＣ型转运载体在机体广泛分布,也主要转运丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸等没有大型支链的中性氨基酸,但不转运Ｎ-甲基氨基酸,分为ＡＳＣＴ1和ＡＳＣＴ2亚型。

另外,β型转运载体主要转运β-氨基酸,包括β-丙氨酸和牛磺酸[1]。

3 酸性氨基酸转运载体家族
酸性氨基酸转运载体家族包括Ｎａ+依赖性的Ｘ-ＡＧ转运载体和Ｎａ+非依赖性的ｘ-ｃ转运载体。

Ｎａ+依赖性转运载体通过Ｎａ+的内流,获得能量主动转运氨基酸,而Ｎａ+非依赖性转运载体则是通过Ｋ+的外流获得能量,如大鼠大脑、人胚胎滋养层、大鼠和家兔的肾脏皮层上皮细胞的酸性氨基酸转运载体。

Ｘ-ＡＧ型分布广泛,在大脑和上皮组织呈高表达,主要转运Ｌ-Ｇｌｕ、Ｄ-/Ｌ-Ａｓｐ及其他酸性氨基酸[4],包括四个同源异构体:ＧＬＡＳＴ(ｇｌｕｔａｍａｔｅ/ａｓ-ｐａｒｔａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ)、ＧＬＴ-1(ｇｌｕｔａｍａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ-1)、ＥＡＡＣ1(ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙａｍｉｎｏ-ａｃｉｄｃａｒｒｉｅｒ1)和ＥＡＡＴ4(ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙａｍｉｎｏ-ａｃｉｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ4)ＧＬＡＳＴ蛋白首先从大鼠大脑分离得到,主要分布在大脑、肺脏、心脏、骨骼肌和胎盘,人的基因为ＳＬＣ1Ａ3,位于5ｐ11-ｐ12,编码573个氨基酸的蛋白质;ＧＬＴ-1蛋白首先从大鼠大脑分离得到,主要分布在大脑和肝脏,人的基因为ＳＬＣ1Ａ2,位于11ｐ11.2-ｐ13,编码543个氨基酸的蛋白质;ＥＡＡＣ1蛋白首先从家兔小肠分离得到,主要分布在大脑和肝脏,人的基因为ＳＬＣ1Ａ1,位于9ｐ21,编码524个氨基酸的蛋白质;ＥＡＡＴ4蛋白首先从家兔小肠分离得到,主要分布在小脑和胎盘,人的基因为ＳＬＣ1Ａ4,编码564个氨基酸的蛋白质[5]。

Ｆａｎ等[16]以肠粘膜上皮细胞分离法结合刷状缘膜泡和放射性同位素示踪及ＲＴ-ＰＣＲ技术研究了以谷氨酸为代表的酸性氨基酸经肠腔进入仔猪肠粘膜细胞的分子生物学过程,结果表明猪及其它哺乳动物肠腔粘膜酸性氨基酸主要由ＥＡＡＣ1转运载体转运,该转运载体在整个肠粘膜细胞的增殖、分化及成熟过程中表达。

4 碱性氨基酸转运载体家族
碱性氨基酸转运载体家族包括Ｎａ+依赖性Ｂ0, +转运载体和Ｎａ+非依赖性ｂ0, +、ｙ+、ｙ+Ｌ转运载体。

Ｂ0, +型转运载体首先在胚泡细胞中发现,主要转运碱性和中性氨基酸[1]。

ｙ+Ｌ型转运载体参与转运中性和碱性氨基酸。

ｂ0, +、ｙ+和ｙ+Ｌ型转运载体基因均属于氨基酸转运载体ＳＬＣ7基因家族。

ｙ+、ｙ+Ｌ、Ｂ0, +和ｂ0, +载体均可转运Ｌ-精氨酸,ｙ+型转运载体是Ｌ-
精氨酸跨膜转运的最主要转运载体,经其摄取的Ｌ-精氨酸约占细胞摄取总量的70%～75%。

Ｌ-精氨酸虽然是半必需氨基酸,是尿素循环、合成蛋白质、多胺和ＮＯ的底物,但也是胎儿发育和生长所需的极其重要的氨基酸,能有效预防子宫内胎儿发育迟缓[17]。

据Ｌａｓｐｉｕｒ等[18]报道,精氨酸ｙ+型转运载体ＣＡＴ1和ＣＡＴ2蛋白在母猪哺乳期间呈高表达,以满足哺乳期间仔猪对精氨酸的高需求。

Ｓｈａｋｅｄ等[19]在人体内寄生的杜氏利什曼原虫(Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｄｏｎｏｖａｎｉ)的前鞭毛体膜上,发现了一种新的精氨酸转运蛋白,含480个氨基酸,该蛋白在酵母中表达后,对精氨酸有高亲和力,且对精氨酸高度特异,不被其他氨基酸或精氨酸类似物抑制。

5 展望
氨基酸转运载体及其功能的深入研究,在揭示氨基酸的转运过程、转运调控机制以及氨基酸营养代谢障碍疾病研究方面具有重要意义。

目前,对大多数氨基酸转运系统摄入、代谢和排出氨基酸的分子识别、转运和调控机制及其生理学功能和致病机制知之甚少,还有待在细胞和分子水平上深入研究。

今后关于氨基酸转运系统的研究应主要集中在其转运机制和功能上,如氨基酸转运载体种类的进一步鉴定;转运载体的分子识别、转运和调控机制;转运载体的非特异性识别所导致的毒性;线粒体膜转运载体的研究及其参与氨基酸代谢的方式;转运载体功能异常与疾病的关系的研究等。