磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图分析技术

微生物生态学的研究方法

——磷脂脂肪酸分析（PLFA）

【内容摘要】定量描述微生物群落是微生物生态学的难题之一。应用传统的微生物培养方法和显微技术, 需要在选择性培养基上培养微生物, 即首先从环境样品中分离出纯菌株, 再对该菌株进行一系列的生理生化分析。文章综述了磷脂脂肪酸谱图分析法在微生物生态研究中的应用，包括估算微生物生物量、确定群落结构、指示特定微生物，指示生理和营养状况等，并指出此种方法存在的问题及改进方法。

【关键词】磷酸脂肪酸微生物生态学应用及发展

一、引言：

环境中微生物的种类和数量是及其丰富的[1]，微生物能把有机质作为营养源转化为组成物质和能量，它们在环境治理过程中扮演着极其重要的作用。分离和鉴定处理系统中的优势菌，了解特定环境下微生物群落的种群分布、遗传多样性及其动态变化规律和认识微生物群落的稳定性及功能菌的作用，是环境微生物学研究的重要内容。传统的微生物鉴定和群分析方法建立在微生物纯种培养分离基础上，但自然环境中有 99%以上的微生物还不能通过人工培养，在微生物的分析和研究工作中具有很大的局限性。

二、正文：

1．磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图分析技术概述

1.1 PLFA 概念、分类和命名

磷脂是含有磷酸基团的脂质，目前已发现了1000多种磷脂类物质。磷脂作为微生物细胞膜主要成分，是甘油分子的第3位羟基被磷酸或其他羟基所酯化形成的。其结构特点是：具有由磷酸相连的取代基团（含氨碱或醇类）构成的亲水头（hydrophilic head）和由脂肪酸链构成的疏水尾（hydrophobictail）。

PLFAs(磷脂脂肪酸，phosphohpids fattyacids)谱图分析方法的原理是基于磷脂——几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分，细胞中磷脂的含量在自然条件下(正常的生理条件下)恒定[ 2 ]，其长链脂肪酸的形式——磷脂脂肪酸PLFAs 可作为微生物群落的标记物。此外，磷脂不能作为细胞的贮存物质，在细胞死亡后将很快降解(厌氧条件下约需2d，而好氧条件下约需12—16d)m，可代表微生物群落中“存活”的那部分群体阁。

White和Findlay[ 3 ]于20世纪70年代末、80年代初发展了PLFAs谱图分析技术，最先提取PLFAs对河口沉积物中微生物群落进行定量分析，成功克服了传统微生物培养及计数方法的缺点。用PLFAs方法定量分析微生物群落的生物量和群落结构不需要进行微生物纯化培养，美国的MI—DI公司已经将这一技术商品化，庞大的数据库基本上涵盖了常见微生物的特征PLFA谱，而且在购得某一菌种的特征PLFA样本后，对仪器的要求也从原来的GC—MS降低为只要GC即可描述种群结构并对某些特征菌属进行知识鉴定。依靠脂肪酸谱图定量描述整个微生物群落，是一种快捷、可靠的检测方法。

脂肪酸通常被分成 6 类[ 4 ]：直链、直链顺单烯（cis-）、直链反单烯（tran-）、支链饱和、环状及多烯脂肪酸（这些脂肪酸优先与磷脂甘油骨架中间C 原子键合）。脂肪酸经甲酯化后形成脂肪酸甲酯（Fatty acid methyl esters，FAMEs），它们又可分为：羟基取代的 FAMEs （OH FAMEs）、酯连接羟基取代的FAMEs（EL-OH FAMEs）、非酯连接羟基取代 FAMEs（NEL-NYFAMEs）、饱和 FAMEs （SA FAMEs）、单不饱和 FAMEs（MUFAMEs）、酯连接多聚不饱和 FAMEs（PU FAMEs）和非酯连接不饱和 FAMEs（UNS FAMEs）。

不同种类的磷脂脂肪酸常以一系列 C 原子数目与希腊字母表示。例如：16∶1ω7c 表示含有 16 个C原子/一个双键/双键距甲基（ω）端7个C原子/顺式构型脂肪酸；也可将不饱和程度置于Δx之后，x 代表距羧基端（Δ）最近的双键位置。脂肪酸构型可用简单符号表示，如顺式 cis（双键两侧-H 在同侧）与反式 trans（双键两侧-H 键在异侧），分别用 c-与 t-表示，因此 16∶1ω7c 也可以表示为 16:1 cis 9；a-与 i-代表异型 Anteiso（甲基在 C 末端第 3 位C 原子上）和同型 Iso（甲基在C末端第二位碳原子上）；br-表示未知甲基支链的位置；ME-前的数字代表甲基取代基团距分子羧基端C原子数；cy-代表了环丙烷脂肪酸；2-与 3-代表羟基脂肪酸的-OH 分别在第 2、3 位C原子上；16:0 FAME 表示 16 个C原子的脂肪酸甲酯。

1.2 PLFA 谱图分析原理

PLFA 谱图分析方法的原理是基于磷脂作为几乎所有生物细胞膜的重要组成部分，细胞中磷脂的含量在自然生理条件下恒定，约占细胞干重的 5%。不同微生物具有不同的磷脂

脂肪酸种类和含量水平，其含量和结构具有种属特征或与其分类位置密切相关，能够标志某一类或某种特定微生物的存在，是一类最常见的生物标记物[ 5 ]。古细菌（Archaea）的极性脂质是以醚而不是酯键的形式出现，不能使用 PLFA 谱图进行分析。由于磷脂不能作为细胞的贮存物质，一旦生物细胞死亡，其中的磷脂化合物就会迅速分解，因而磷脂脂肪酸可以代表微生物群落中“存活”的那部分群体。

由于各种菌群的微生物生物量和群落组成不同，不同菌群具有独特的 PLFA 特征谱图（包括 PLFA 总量、组成），为此磷脂脂肪酸构成的变化能够说明环境样品中微生物群落结

构的变化，可以对微生物群落进行识别和定量描述。细菌的生物量（bact PLFAs）可以通过 i15∶0，a15∶0，15∶0，i16∶0，16∶1ω9，16∶1ω7t，i17∶0，a17∶0，17∶0，18∶1ω7，和 cy19∶0 的 PLFA 的总含量进行估算；真菌的生物量通过 18∶2ω6 的含量估算；可用16∶0（10Me），17∶0（10Me），18∶0（10Me），i15∶0，a15∶0，i16∶0，i17∶0和 a17∶0 的总含量来估算革兰氏阳性菌的含量，可用16∶1ω5，16∶1ω7 t，16∶1ω9，cy17∶0，18∶1ω5，18∶1ω7 和 cy19∶0 的总含量来估算革兰氏阴性菌的含量[6]。

1.3 PLFA 的提取与鉴定

1.3.1 PLFA 的提取

1.3.1.1 纯培养微生物的提取

通过碱甲醇分解法提取纯培养微生物的FAMEs（TotalSoil Fatty Acid Methyl Esters，TS FAMEs）[7]。其步骤为：（1）取40mg 菌体细胞，加1mL 3.75mol/L NaOH 甲醇-水（体积比为1∶1），涡旋振荡后于 100℃水浴保温30min此过程中细胞溶解，脂肪酸从细胞磷脂上水解下来并转移到钠盐上）；（2）加入2mL的