基因组印记与研究方法

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5.1.1 孤雄胚胎（Androgenetic embryos AG ） 方法： 去核MⅡ期卵母细胞双精受精。 受精胚胎去雌原核，并用第二个精子来源的 雄原核取代雌原核。 细胞核融合。 AG胚胎发育迟缓，相对于胚胎，胚外组织发 育较好。
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5.1.2 Parthenogenetic embryos (PG) 一般常由未受精的卵母细胞获得。 有些小鼠品系有很高的自发孤雌生殖率：如 LT/SV品系、c-mos缺陷小鼠。 电激活 化学诱导：乙醇诱导（非整倍体） Sr2+诱导
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2.5 基因印记的发生常有组织特异性和 发育阶段特异性。
2.6 基因组中存在印记维持元件，这些 印记维持元件的缺失会导致部分印记基 因印记的丢失。
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2.7 印记基因在真兽哺乳亚纲动物保守。在 小鼠中发现的印记基因一般在其他哺乳动物 也表现印记特征，但少数基因例外（Cd81、 Igf2r）。见表
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印记基因中来自双亲的两条等位基因只有一个表达， 另一个不表达或表达甚微。
母系印记：母本等位基因沉默（父本表达）的印记 基因称为母系印记基因。如：Igf2 ，Ins , Ndn. 父系印记：父本等位基因沉默的印记基因称为父系 印记基因。如：Cpa4, H19,Cd81.
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目前在昆虫、植物、在真兽哺乳亚纲动物 （eutherian mammals）和有袋类动物 （marsupials）中发现了印记现象；而在单 孔类（monotremes）和鸟类中没有发现印记 现象。
罗伯逊易位、相互易位和定向染色体重排 罗伯逊易位（图a）和相互易位（图b）杂合 子杂交可以分别生产一条染色体或染色体片 段UPD、单亲重复/缺失的小鼠。 平衡易位可以确定某个染色体或染色体片段 是否含有印记基因。
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定向染色体易位可以产生和罗伯逊易位相似 的结果。可以在目的染色体区域定向产生插 入、缺失、重复、相互易位。 利用Cre– loxP重组酶系统进行基因打靶将 染色体重排引入目的区域。
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5.1.3 Gynogenetic embryos (GG) 一般用原核移植方法。 GG和PG在发育潜能上几乎没有什么差异， 所以用于PG的方法一般也可以用于GG。 但是，受精得到的雌原核与激活得到的雌原 核是否是等价的还不清楚。 PG和GG 胚外组织发育不良。
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5.1.4平衡易位分析印记基因组区域
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5 基因组印记的研究方法
验证基因印记最基本的方法： Mat(AA) × Fat(BB) F1(AB) RT-PCR-SSCP
F1 （AB） 不印记 （A） 父系印记 （B） 母系印记
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5.1 构建单亲二体型胚胎 利用核移植技术和细胞核融合（HVJ或仙台 病毒辅助融合）生产单亲二体型胚胎，用以 研究印记和发现印记基因。
基因组印记与研究方法
报告人 : cgl 2006年10月17日
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主要内容
1 基因组印记与印记基因 2 印记基因的特征 3 可能的印记机制 4 基因组印记与百度文库病 5 基因组印记研究方法
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1 基因组印记与印记基因
1 Genomic imprinting is a phenomenon in which alleles of a gene are expressed differentially depending on their parental origin. Those whose expression is dependent on the parental origin of the allele are known as imprinted genes.
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5.6 分析印记基因的甲基化、乙酰化 PCR 重亚硫酸盐方法 在重组DNA中体外甲基化某些区域 确定甲基化敏感性-DNA结合蛋白
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CTCF
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3.2 乙酰化 组成核小体的组蛋白的不同氨基酸残基的乙
酰化一般和活化的染色质构型和有表达活性 的基因相关联。 H4组蛋白的乙酰化可能通过调节染色质的结 构参与印记。
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Igf2-H19 区域启动子区内H4的乙酰化水平在 两条亲本染色体上存在差异，表达的等位基 因比沉默的等位基因乙酰化水平高 。 CTCF结合蛋白和组蛋白去乙酰化活性有关。
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Igf2-H19 的印记机制: Igf2-H19 区域定位于小鼠7号染色体、人 11号染色体。 Igf2 编码胎儿的一个生长因子，父本等位 基因表达。 H19的转录物是功能未知的非编码 RNA， 母本等位基因表达。
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CTCF蛋白是一个锌指蛋白，结合到特定 DMR上起绝缘子作用，这种作用具有位置依 赖性。 CTCF还介导interchromosomal association,(小鼠7号染色体的Igf2-H19和染 11号色体的Wsb1-Nf1).这种 interchromosomal association 可能参与 基因组印记。
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YAC: 500-600kb BAC: 300kb PAC：P1-derived artificial chromosomes 300kb
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ES细胞是囊胚内细胞团（ICM）的细胞培养 物，ICM产生胚胎和胎盘的羊膜、卵黄囊、 尿囊部分。囊胚注射实验表明ES细胞和ICM 相似，但是二者不同。ES细胞可以被认为是 ICM细胞：在体外外源性因子作用下，被停 止在未分化的状态的某个细胞周期。
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2 .2印记基因复制的异步性。 Igf2-H19区域的复制：父源等位基因复制早 于母源等位基因。
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2.3 染色体上基因印记的发生具有空间位置 的限制性，同一条染色体上两个印记基因之 间的基因、与印记基因相邻的基因通常不表 现印记修饰。
2.4 印记基因的发生常与该基因编码区、启 动子区以及其上下游区域特定的CpG序列有 关，这些特定序列的甲基化状态常影响亲本 特异性。
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5.4 实验验证印记基因的印记状况 一般有以下两种途径： 同一个基因在不同品系间有差异，进行种间 互交。一般在小鼠上常用。 利用SNPs，不同个体间存在等位基因间的 差异，然后这些个体进行杂交。利用杂交后 代。
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5.5 利用生物信息学方法预测印记基因 一般从DNA序列特征分析： 重复元件 转录因子结合位点 CpG岛
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5.3 Methylation-Sensitive Genome Scanning 一般印记domain内存在parental-allelespecific CpG methylation. 所以寻找亲本等位基因特异性CpG甲基化有 助于寻找印记基因。 RLGS:restriction landmark genome scanning
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5.1.4 利用ES细胞
ES细胞可用来研究基因组印记A ：是双倍体可以只 含有母本或父本的两条染色体或染色体片段的单亲 重叠。 B : retain imprints as assessed by the developmental potential of chimeras. C ：除了能提供体内嵌合体生产系统外还提供了一 个未发育的胚体生产的未分化的体外分化系统。 D ：可以提供大量的细胞材料如进行染色质DNA的 研究。 但是他们的分化和无限的分裂能力会导致表观遗传 的改变。
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3可能的印记作用机制
3.1 DNA甲基化 DNA甲基化是一种DNA结构修饰。它 一般和基因沉默相关联，去甲基化常和 沉默基因的重新激活有关。 DNA甲基化的转录调控可能参与哺乳动 物基因组印记的产生。
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在印记区域亲本等位基因一般存在甲基化差 异，这些区域称为差异甲基化区 （ differentially methylation region ， DMR）。 DMR 在调控基因印记中起重要作用。
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Dlk1-Gtl2 印记区域： 该区域位于小鼠12号染色体远端、人 14q32、绵羊18号染色体远端。 Dlk1, Peg11,Dio3 是该区域的蛋白编码基 因，是Sushi-ichi 样逆转录因子的Gag、Pol 的同源物。
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4基因组印记异常与疾病
基因组印记异常常和各种发育紊乱和疾病相 关，这些紊乱和疾病通常是由不正确的调节、 剂量改变和突变造成的。 印记基因的表达异常可能引起癌症、神经行 为和发育异常，还能影响母性行为。
目前在小鼠和人上已经发现了100多个印记 基因（印记转录单元）。见表 Back
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2 印记基因的特征
2.1 印记基因常成簇存在。如印记基因 Mash2、Ins、Igf2、H19位于染色体上不到 400kb的范围内。 如小鼠7号染色体 p57KIP2, KvLQT1 and Mash2---Insulin-2(Ins-2) and Igf2---H19。 人15号染色体： ZNF127 --SNRPN---IPW (encodes RNA) 。
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3.3 Micro RNA MicroRNA（miRNA）是指长度为21－25nt
的小型非编码RNA，由具有发夹结构的约7090个碱基大小的单链RNA前体加工而成,通过 抑制翻译或导致mRNA降解机制参与广泛的 发育和细胞过程。 有些印记区域含有miRNA，参与印记的发生。 如Dlk1-Gtl2 区域中antipeg11。
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5.2 转基因技术研究印记控制区和控制元件 小转基因载体研究印记的缺点：有时不能包 括基因调控元件；易受染色体位置效应影响。 YAC、 BAC、PAC等大的转基因载体容量 大、拷贝数少，更能精确的表现目的基因的 表达模式和表达水平。 确定印记区域和印记区域内的印记调控元件。
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重复元件： 一个基因侧翼的重复元件的数量、类型、相 对方向对预测一个基因是否是印记基因非常 重要。 有研究表明印记基因侧翼有低密度的短散布 转座元件，这些元件的方向具有更重要的作 用。
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转录因子结合位点： 如：SRF（serum response factor）、 NFuE1、AP2 有些元件对于预测亲本优先表达上具有重要 意义：基因上游LINEL1的相对方向、下游的 LINE L1ME 的方向 、上游的MaLR 、LTRs 的方向等等。