TaqMan探针法实时荧光定量PCR的应用和研究进展

TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 的应用和研究进展

姜文灿，岳素文，江洪，王成彬

姜文灿，温州医科大学检验医学院、生命科学学院2014级硕士研究生。主要研究方向为分子生物学技术。

[摘要] TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 因其重复性好、特异性强、线性范围宽等特点在各个领域有着广泛的应用，内标系统的引入进一步提升了该方法的灵敏度，增加了其可靠性和实用性。然而，这一技术也因为假阴性和假阳性问题存在着改进的空间。本文从TaqMan 探针法的简介、研究进展以及应用前景展开综述。

[关键词] 实时荧光定量PCR ；TaqMan 探针；引物二聚体；内标系统

[中图分类号] R446.6-3 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 2095-2775（2015）01-0797-09 Application and research progress of TaqMan probe real time PCR

[Abstract] TaqMan real-time PCR has been widely used in various fields because of its good repeatability, strong specificity, wide linear range, etc. Import of the internal control (IC) system further improved the sensitivity of this method, consequently increased its reliability and practicability. However, there are still some improve rooms for this technique because of the false negative and false positive problem. Here we proceed a review for TaqMan real-time PCR cover its introduction, research progress and applicative prospect.

[Key words] Real-time fluorescent quantitative PCR; TaqMan; primer dimer; IC

[作者简介] 姜文灿，2014级硕士研究生。主要研究方向为分子生物学技术

[作者单位] 325000 浙江温州 温州医科大学检验医学院、生命科学学院（姜文灿，王成彬）；100085 北京 北京泰格瑞分子检验有限公司（岳素文，江洪）

[通讯作者] 王成彬，E-mail ：wangcb301@

聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain Reaction, PCR ) 是在体外模拟体内核酸复制从而获取大量目的基因拷贝的技术，最早由Mullis [1]发明。其几何级数的放大模式，相比于普通信号叠加的检测方法灵敏度提升了上百万倍，同时又因操作简便，成为核心技术之一。实时荧光定量 PCR 是在传统 PCR 基础上加入信号系统达到实时监测 PCR 扩增的目的，继承了传统 PCR 高灵敏度和操作简便的特点，同时实现了对样本的定量检测。根据信号基团的不同，实时荧光定量 PCR 可以分为染料法和探针法。非特异的染料法成本较低，但面临着类似于普通 PCR 非特异性扩增产物干扰的假阳性问题[2]。探针法中使用的探针多是 TaqMan 探针，与染料法相比，在一定程度上避免了假阳性问题的出现。现阶段， TaqMan 探针技术在医药卫生、农业科学、生物科学、政治法律等方面得到了广泛的应用[3-6]。

1 TaqMan 探针法简介

1.1 原理 TaqMan 探针的基本原理是利用扩增过程中Taq 酶的5’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针，该探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针在PCR 过程中延伸[7]，当引物延伸至寡核苷酸结合位置时，Taq 酶可以将其切割成小片段，使报告基团和淬灭基团分开并发出荧光（图1），经过检测伴随扩增产物增加过程中荧光强度的增长对样本进行定量分析。现阶段使用的荧光报告基团有HEX 、FAM 、ROX 、JOE 、VIC 等[8]，荧光淬灭基团主要有TAMRA 、BHQ 等。研究发现，BHQ 本身具有非常低的荧光背景，实用性

高于TAMRA[9]。

图1TaqMan水解探针作用机理图

为了实现定量，我们往往以PCR反应的第3～15个循环的荧光值作为荧光本底信号，以3～15个循环的荧光值增加量标准偏差的l0倍为荧光阈值，根据信号达到该荧光阈值的循环次数（Ct值）和标准曲线判定结果。Ct值和荧光阈值一般要经过15次测试才能确定[10]，标准曲线要借助外标准品的检测完成，而外标准品制备的方法有直接化学合成、从标本获取和使用纯化病毒产物制备三种，其中实用性最高的为第三种[11]。Stone等[12]提出标准品要具有强稳定性的特点，DNA也要高度纯化并得到精确稀释。此外，在反应过程中，理论上每经过3.3个热循环靶模板总量增加一个数量级，故而标准曲线的斜率应在-3.3附近[13]。

1.2反应体系和使用仪器TaqMan探针法需要在传统PCR扩增体系中加入特异性TaqMan探针，同时选择性加入内标系统，总体积50μl、40μl、30μl、25μl、20μl均可见，一般进行40~45个循环。同普通PCR，TaqMan探针法中各成分含量的变化也会影响实验结果，而实验结果需要通过Ct值和荧光增值（Rn）获取，所以在检测前一般遵循Ct值最小、Rn最大的原则对体系进行优化[14]。此外，加入ROX染料可以校正背景荧光[15]；对于引物的合理性，可以通过产物电泳和熔解曲线分析来确定[16]。反应体系中使用的是不同荧光素标记的探针，因此检测的完成要借助多通道PCR扩增仪，比如ABI 7500扩增仪、罗氏公司的Lightcycler扩增仪、Stratagene Mx3005扩增仪、达安公司DA7600扩增仪、Bio-Rad I cycler扩增仪以及Axygen公司的Mx300P扩增仪[17-22]。其中Roche公司的荧光定量系统采用的是毛细玻璃管形式，升降温速度相对于普通管更快，反应时间也更短[23]。在这种反应管中加入牛血清蛋白（BSA）能减少玻璃壁对核酸聚合酶的吸附，起到保护Taq DNA聚合酶的作用，从而提高体系的扩增效率[24]，但这一方法并不适用于普通反应管。

在对样本进行检测时，并非模板浓度越高扩增效率越高，浓度太高的模板会干扰PCR反应，使扩增效率降低[25]。试验中，我们也可能遇到样本收集不全面的问题，对此，曹冬梅等[26]在使用TaqMan探针进行伤寒沙门氏菌检测时，采用了模拟样本的方式，即在无感染样本中加入不同浓度的细菌，得到多种模拟阳性样品进行检测；此外，他们还使用日本PPS公司的E7001核酸提取仪获得了更多更纯的模板。而胡骑等[27]在对口蹄疫病毒进行检测时，使用的是ABI公司的Magmax Express核酸自动提取系统，这一系统为车载便携式，30min可以同时完成24份样本的提取，为核酸的获取提供了一种新的方法。

1.3 TaqMan探针法的特点TaqMan探针法巧妙的结合了PCR对核酸的高效扩增、探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性，克服了常规PCR只能实现定性检测的不足[28]。该技术实行完全闭管式操作，不仅避免了传统PCR开盖引起的产物污染问题，减少了假阳性现象的出现，还避免了对环境的污染[29]。由于其操作简便，判断结果直观明了，整个检测过程只需要2~3h[30]。相比于传统PCR电泳的方法，该技术的检测结果以更客观的数据形式呈现，可对样本进行阳性、阴性和可疑的判定，从而确保结果的准确性[31]。其特异性有引物和探针双重保证，

进一步增