8酶分析法 ppt课件

4、特点： 不需要特殊仪器 容易找到具体测定方法 色源底物和荧光源底物发展快
（二）连续测定法
1.连续测定法：基于底物和产物在物理化 学性质上的不同，在反应过程中对反应系 统进行直接连续检测的方法。
2.常用的检测方法
连续测定法
基于底物和产物在物理化学性质 上的不同，在反应过程中对反应 系统进行连续检测的方法。 连续测定法的准确性和测定效率 比较好
比活力:每mg蛋白质所含的酶活力单位 数表示，
比活力=活力U／mg蛋白=总活力U/总蛋 白mg
有时用每g酶制剂或每m1酶制剂含有多 少个活力单位来表示(U／g或U／ml)。
比活力大小的含义：可用来比较每单位 质量蛋白质的催化能力。比活力愈大， 表示酶的纯度愈高。
活力单位(U)与比活力
U＝速度单位
一般选用底物的浓度[S]=100 Km 一般选择Km小的作测定的底物。
（2）pH值 注意选择适宜的反应pH值， 并将反应维持在这一pH值。
乳酸脱氢酶
例：丙酮酸
乳酸
pH对酶反应的影响
pH影响酶活力的原因
(1) 过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏， 引起酶构象的改变，酶活性丧失。
(2) 当pH改变不很剧烈时，酶虽未变性，但 活力受到影响。
三、酶活力的测定方法
按取样及检测的方式 （一）取样测定法 （二）连续测定法
（一）取样测定法
1.取样测定法：求得单位时间内酶促 反应变化量的方法。
2.常用的检测方法：紫外-可见分光 光度法、荧光分析法等。
取样测定法
在酶反应开始后不同的时间，从反应系统 中取出一定量的反应液，并用适当的方法 （添加酶的变性剂或使酶失活）停止其反 应后，再根据产物和底物在化学性质上的 差别，选用适当的检测方法进行定量分析， 求得单位时间内酶促反应变化量的方法。
温度对酶反应的影响
机理：
温度导 致酶蛋 白变性
最适温度
温度对酶反应的影响
在最适温度之前，一般温度越高，反应速 度就越快。
酶的固体状态比在溶液中对温度的耐受力 要高。通常酶制剂以固体保存为佳。
（5）空白和对照
空白 指杂质反应和自发反应引起的变化量，提 供未知因素的影响
对照作为比较或标定的标准。
取样测定法
取样测定法一直沿袭至今是因为： 不需要特殊仪器 几乎所有酶反应都可根据产物或底
物的化学性质找出具体的测定方法 由于色源底物和荧光源底物的发展，
可在原来的底物分子上接上相应的 有色基团、发色基团或荧光基团。
3、终止酶反应：添加酶的变性剂 三氯醋酸：紫外光区有吸收 高氯酸：对酸和氧化剂敏感的对象不适用
P y r + N A D H + H + L + N A D +
二、荧光分析法 三 华勃氏呼吸仪检压法 四、放射性同位素测定法
华 勃 氏 微 量 呼 吸 仪 （ 瓦 氏 呼 吸 仪 ）
五 电化学法（electrochemical）
pH测定法：用高灵敏度的pH计，跟踪反 应过程中H+变化的情况，用pH的变化来 测定酶的反应速率。
酶I) 和NADP+(烟酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸, 又称为辅酶II )是维生素烟酰胺的衍生物，
NH2
CONH2 O- O- N
N+ O
CH2OPOPOCH2
N O
OO
N N
OH OH
OH OH(OPO3H2)
+
N
R
NAD+
O C NH2
还原 氧化
O C NH2
N
R
NADH
300-400nm无吸收
在338.5nm与340.5nm之 间有一个最大吸收峰
概述
3.酶分析法包括两种类型： 一是以酶作为分析对象，这类分析方法称
为“酶活力测定”。 二是以酶作为分析手段，用以测定样品中
用一般化学方法难于检测的物质，通常将 这类分析方法称为“酶法分析”；
4.两类酶分析法的区别
相同：从原理到方法 不同：
酶活力测定法中，是以酶为分析对象。 使用的底物应该过量。 酶法分析中，是以酶为分析工具或分析试 剂,被检化合物（如：底物）是反应的限 制因素
已知［S］＝9Km,求该酶体系的反应速度 为何值？
过氧化氢酶的Km为2.5×10－2mol/L， 当底物浓度为100mmol/L时，求反应速 度达到最大速度的百分数？
第一节 酶活力测定法
一、基本概念 二、酶促反应的条件 三、酶活力的测定方法 四、测定过程中应注意的问题
一、基本概念
1.酶活力：指酶催化一定化学反应的能力。 2.酶活力的测定：是测定一个被酶所催化
离子选择电极法：测定某些酶的酶活力， 用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应， 如葡糖氧化酶的活力就可用这个方法很 方便地测定。
第二节 酶法分析
一、终点测定法 二、反应速度法
一、原理
是在以待测物质为底物的酶反应中，如果 能使底物能够接近完全地转化为产物，而 且底物或产物又具有某种特征性质，通过 直接测定转化前后底物的减少量，产物的 增加量或辅酶的变化就可以定量待测物— —平衡法
的化学反应的速度。 3.酶活力测定的目的：通过酶反应速度的
测定，求得酶的浓度或含量
酶活力(enzyme activity)的测定
1．酶活力 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，
酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一 化学反应的反应速率来表示，酶催化的反应速率 愈大，酶的活力愈高；反应速率愈小，酶的活力 就愈低。两者呈线性关系。
国际酶活力单位
1961年,国际生物化学协会酶学委员会提 出采用统一的“国际单位”(U)来表示酶 活力，规定为：在最适反应条件(温度 25℃)下，每分钟内催化1微摩尔(umo1) 底物转化为产物所需的酶量,定为一个酶 活力单位，即
பைடு நூலகம்
1 U = 1 umol／min。
酶的比活力(specific activity)
酶促反应速度的测定方法
[P]
产
V0
物
浓
度
VX
反应初速度 Vo
提问：为什么反应速度会随 时间减小？ 答案：1.[S]降低；
2.酶受到产物抑制
提问：用哪一个速度来表示
该酶促反应的速度特征呢？
0
初 X产物浓度变化曲线时 间 T 反应
速度表示酶活力。
提问：仅用反应初速度大小对比酶活力行吗？
答案：不行，还与酶的加入量及条件有关。
例 1、
丙酮酸 +NADH+H+
乳酸+NAD+
LDH
例 2、
GOT
天冬氨酸+a-草酰酮戊二酸
谷氨酸+草酰乙酸
MDH
草酰乙酸+NADH+H
苹果酸+NAD+
酶偶联测定法：是应用过量、高度专一的 “偶联工具酶”使被测酶反应能连续进行到某一可 直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。
① 被测反应
H K
G +A TP
等。 因此测定酶活力，应测定酶促反应的初速率，
反应初速率与酶量呈线性关系，因此可以用 初速率来测定制剂中酶的含量。
检验酶反应和测定系统是否适宜的标准
测得的反应速度必须和酶浓度间有线 性的比例关系
一、基本概念
4.酶反应的速度：用单位时间内反应底物 的减少或产物的增加来表示，酶反应的速 度愈快所表示的酶活力愈高。
共同点：原理和方法相同，以酶 的专一高效催化某化学反应为基 础，通过测定酶反应的速率或生 成物浓度来检测相应物质的含量。
酶法测定的原则
、酶活性的测定1
2、代谢物浓度的测定
3、酶底物复合物
K1
K3
E+S
ES
K2
E+P
酶反应动力学
1、米氏方程
• 1）. 米氏方程
Vmax [S] V= Km + [S]
酶活不能反映酶的使用效果 只能用于产品质量的控制
测定过程中应注意的问题
产物的测定 反应速度的测定 测定要达到的要求
生化药物制剂检验程序
c/mg/mL
6
酶量
50
5
40
4
30
3
20
2
10
1
0
0
5
10
15t/min 20
酶反应进程曲线
生化药物制剂检验程序
反应速率
0.6
0.5
t/min
t=5
0.4
G -6-P +A D P
偶联指示反应
G 6 P D H
G - 6 - P + N A D P
N A D P H + 6 - P - G C O O H
② 被测反应 肌激酶
A M P + A T P
2 A D P
辅助反应
丙酮酸激酶
A D P + P E P
A T P + P y r
指示反应
乳酸脱氢酶
酶活力测定实例
脂肪 脂肪酶 甘油 + 脂肪酸
首先 确定反应条件 20℃、pH=7，底物浓度 6g/l（过 量），加入2mg固体脂肪酶
第二 确定活力单位 如每小时催化1克底物 1u= 1g/h
第三 测算反应初速度 作产物甘油随时间增加的曲线， 量出反应初速度值 ，换算为脂肪的消耗速度 如 8g/h
每小时催化1克底物
每小时催化1ml某浓度溶液
每分钟催化1ug底物
酶产品质量评价中常使用比活力
单位质量酶产品中酶活力称比活力。
u/mg酶蛋白
u/ml酶蛋白
国际单位（IU）：在实验规定的条件下（25℃， 最适pH、最适底物浓度时），1ul标本，以每 分钟能催化1微摩尔底物的酶量为1个国际单位。
影响了底物的解离状态； 影响酶分子活性部位上有关基团的解离； 影响到中间络合物ES的解离状态，不利于催
化生成产物。
二、酶促反应的条件
（3）温度 实验中温度变动应控制在 ±0.1℃以内。酶反应的温度通常选用 25℃、30℃、37℃。
（4）辅助因子 为了提高酶在反应系统中 的稳定性，有些也需要某些相应的物质。
酶法分析的优点
1 用于复杂组分中结构或物理化学性质比 较相近的同类物质的分离鉴定和分析。 2 特异性强、干扰少、操作简单、样品和 试剂用量少，测定快速精确，灵敏度高等 特点。 3 通过了解酶对底物的特异性，可以预料 可能发生的干扰反应并设法纠正。 4 可用偶联反应。 5 无污染或污染很少的分析方法。
• Km值只是在固定的底物，一定的温度和 pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不 同条件下具有不同的Km值。
• Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km
值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;
Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。
计算题
要求酶按其最大反应速度的99%的速度进 行反应，求所需底物浓度［S］。
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教学目的和要求
熟悉： 1．酶活力的测定方法 2．酶法分析的测定方法
了解：酶分析法的原理
概述
1.酶的概念是生物体内产生并具有催化活 性的一类蛋白质，由于表现出特异的催化 功能，因此酶被称为生物催化剂。
2.酶的应用：在体外进行催化反应 ①用以制造某些产品 ②用以去除某些物质 ③用以识别某种化合物 属于“酶分析法” ④用以测定某种物质
所以测定酶的活力就是测定酶促反应的速 率。
酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产 物的增加量来表示。
在实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。
V = [p] / t
[p] = v t
[P]
产
V0
VX
物
浓
度
0
X
时间T
引起酶促反应速率降低的原因
(1)底物浓度的降低； (2)产物浓度增加加速了逆反应的进行； (3)产物对酶的抑制或激活作用 (4)随着时间的延长引起酶本身部分分子失活
第四 换算活力
8g/h / 1g/h=8u
第五 计算比活
8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白
活性 部位
作业
根据所学知识推导出米氏方程。
二、酶促反应的条件
基本要求： 反应系统中除了待测酶的浓度是影响速度
的惟一因素外，其他因素都处于最适于酶 发挥催化作用的水平。
确定反应条件时应考虑：
（1）底物 选用的底物在物理化学性质上和产物不同。
Km 即为米氏常数， Vmax为最大反应速
度
当反应速度等于最大速度
一半时,即V = 1/2 Vmax,
Km = [S]
上式表示,米氏常数是反应 速度为最大值的一半时的底 物浓度。
因此,米氏常数的单位为 mol/L。
2、Km米氏常数意义及推导过程
• 不同的酶具有不同的Km值，它是酶的一个 重要的特征物理常数。
t=10
0.3
t=15
0.2
0.1
0
0
10
20
30
40
50
60
酶量
酶浓度曲线的关系
酶分析法的检测方法
酶分析法的检测方法
最常用的方法介绍如下：
(1) 紫外-可见分光光度法 (2) 荧光分析法 (3) 旋光度法 (4) 酶偶联测定法 (5) 其他检测法
一、紫外-可见分光光度法
• NAD+ (烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又称为辅
5.测定酶活力的方法：可用物理法、化学 法或酶分析法等方法。
一、基本概念
6.常用的酶分析法
第一，终点法 第二，取样测定法 第三，连续测定法
一、基本概念
7.酶的活性单位（国际单位U）：在25℃及最 适条件下，每分钟能转化一个微摩尔(μmol)底 物的酶量定为一个活性单位。
8.酶的比活性：为一毫克(mg)酶的活性单位数 目。