基因工程抗体片段

双特异抗体的临床优势
• 1）靶向性好：用高价BsAb 靶向目标抗原可使药物选 择性地结合到高抗原密度的肿瘤组织区，正常组织抗 原密度低于BsAb 的结合域值，因而BsAb极少渗透入
正常组织，从而提高了BsAb 的靶向性；。
• 实例：Lu 等设计了3 价抗ErbB2 /CD16 的BsAb，它 包括2 个结合ErbB2 的ScFv 形式结合位点和一个定 位于NK 细胞的单价Fab 片段位点；
高的同源性；
• 2）比较人类和骆驼IgG 重链可变区发现，在框架
FR2 区的氨基酸组成中，有4 个氨基酸显著不同。这 4 个氨基酸在VH 和VHH 中分别是V42F 或V42Y， G49E，L50R 和W52G，，
• 利用这一特点, 可以对人源抗体VH 结构
域FR2 中的一些氨基酸进行VHH特征性
第二代小分子抗体———单链抗体 ( single chain Fv，ScFv)
• ScFv指在重链V区cDNA5’端与轻链V区cDNA5’
端之间用一寡聚核甘酸连接, 在大肠杆菌中表 达成一单链多肽, 并在细菌体内折叠成只由重 链和轻链可变区构成的一种新型的抗体, 大小 仅为完整Ig的1/6(约28KD);
• 是含有完整抗原结合部位的最小抗体片段；
ScFV的功能
• 1）用于治疗：可进人一般抗体不能达到的部
位, 如蛋白偶联受体、酶活性部位和病毒表面
的腔囊等；
• 2）多肽接头可设计为具有特殊功能的位点： 多肽接头是单链抗体的独特组成,可设计为具 有特殊功能的位点：如金属赘合、连接毒素或 药物等, 用于影像和临床治疗；
改造, 所得到的骆驼化单域VH 抗体不仅
保持原有的抗体的特异性和亲和力, 而且
溶解性好、稳定性好。
2. 分子识别单位( molecular recognition unit，MRU)
• MRU 是由单个互补决定区组成的小分子抗体
片段，约为完整抗体分子的1/80 ～ 1 /70。 MRU 也具有与抗原结合的能力，且由于其穿 透力强、半衰期短、显像时本底低，在临床诊 断中具有潜在的应用前景。
第三代小分子抗体———纳米抗体和 分子识别单位( molecular recognition unit，MRU)
• 1. 纳米抗体主要指仅由一个重链可变区 组成的单域抗体( VHH)，其体积约为完 整抗体的1 /10，故称为纳米抗体；
纳米抗体的来源
• 1993 年Hamers 等偶然发现骆驼体内存在一 • 种仅具有重链的抗体，被称为重链抗体( heavy-chain antibodies，HCAbs) 。此后，在一些软骨鱼，如护 士鲨体内也发现类似骆驼重链抗体结构的新抗原受体 ( new antigen receptor，NAR) 。 • 这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区 VHH( variable domainof the heavy chain of HCAbs， VHH) 单结构域形成，尽管缺失轻链可变区，却仍具 有良好和广泛的抗原结合力； • 克隆这种抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变 区组成的单域抗体( VHH)。
• 工程化的细胞内抗体为探索膜蛋白新的功能提
供了重要的分子靶向工具。
分泌型的BsAb
• A majority of both bispecific diabodies and bis-scFv are designed to bind to the CD3 T-cell coreceptor and thereby recruit cytotoxic T-cells (CTLs) to the tumor site.
基因工程抗体片段之进行曲——— 抗体片段的改造和改型
• 通过对小分子抗体基因的改造和修饰，改善其 亲和力、免疫原性及效应，构建出多种基因工 程抗体片段. • 目前已有54 种基因工程抗体片段进入临床研 究，其中30 种源自Fab ( 56%) 、19 种源自 ScFv( 35%) 、5 种源自第三代小分子抗体
Fab的临床应用
• 1）阿昔单抗( abciximab，ReoPro)
• 1994 年12 月FDA 批准的第一个重组Fab 片段，该产品以血小 板糖蛋白Ⅱb /Ⅲa 为靶点，用以防止血小板聚集及血栓形成，作 为冠状动脉导管插术时预防心肌缺血的辅助用药，取得了巨大的 成功； • 2）兰尼单抗( lucentis)：治疗黄斑变性， 2006 年获得FDA 的 批准。 • 3）赛妥珠单抗( cimzia)：克罗恩病和风湿性关节炎，2008 年 获得FDA 的批准。 • 在临床研究中，Fab 占据了临床研发抗体片段的大多数( 30 /54 种) 。
体。例如Fab就被用化学连成二价或三
价的多聚体, 实验表明其与抗原的保持性
有所提高；
最成功的设计
ScFV
缩短Linker 0—5个氨基酸
二价双链抗体
2.双特异性抗体( bispecific antibody，BsAb)
双特异性抗体的 2个抗原结合部位
一个 结合靶细胞上的特异性抗原
另一个结合淋巴细胞或吞 噬细胞等效应物
• 2）是一种有效的抗肿瘤策略：Michaelson 等将抗 LTβR 的ScFv 片段融合于抗TRAIL-R2 单抗的重链端， 设计了以TNF家族膜受体TRAIL-R2 和LTβR 为靶点
的IgG 样BsAb。该抗体血浆半衰期长，体外实验中能
有效抑制多种肿瘤细胞的生长，在小鼠肿瘤移植模型 中较之亲本抗体能更显著地减小肿瘤体积；
亚细胞部位的活性分子或者触发免疫反应，即
为细胞内抗体( intrabody). • 细胞内抗体主要应用于疾病的基因治疗。
细胞内抗体的应用举例
• Hayashi 等成功合成了针对γ 分泌酶复合体重 要成分nicastrin( NCT) 的ScFv 胞内抗体，生 化分析结果显示，该抗体能扰乱内源性NCT 的正常折叠和糖基化成熟，进而影响γ 分泌酶 复合体的稳定性及内源蛋白水解活性。
两条抗原结合臂可分别来自 FV段、Fab段、ScFV或dsFv
导致效应细胞靶向杀灭 肿瘤细胞
双特异抗体的设计和运用
• 化学交联：分别分离纯化两种亲本单抗，采用还原剂 使其解链，获得单价抗体，再采用异双功能交联剂， 把两种具有不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联 起来； • 细胞工程：采用细胞融合的方法，将分泌单抗的杂交 瘤与经免疫的脾细胞结合，或者使两种分泌不同单抗 的杂交瘤细胞融合； • 基因工程：多采用抗体分子片段，Fab、ScFV等经过 基因操作修饰后，通过体外组装成BsAb或者直接表达
• 重组Fab 是将轻、重链可变区分别与人抗体的
κ 链和重链CH1重组；
Fab 基因工程构建方法及其性能
• 通常是保留鼠源性的CDR区, 其余换成人源化,通 过大肠杆菌以分泌表达的方式表达L链和Fd链, 二者能在细菌的外周质腔中折叠成具有一定构象 的Fab； • 该Fab具有抗体的活性。因为其不含有Fc段、分 子量小、结合力高、抗原性低, 故在肿瘤治疗上 有其优越性。目前已有多个片段药物获得FDA 批准上市.
( 9%)
1.双链抗体Diabody
设计背景
• 由于单价抗体片段(如ScFv、Fab)与靶
抗原作用后保留时间短且解离速度快, 所
以在实际应用中有必要设计多价抗体分
子, 这种多价分子可显示出与抗原更加强
的亲和力和慢的解离速度；
• Fab和ScFv片段能够通过化学的或基因
工程linker构成二聚体、三聚体或四聚
基因工程抗体片段
----谱写抗体家族的新乐章
基因工程抗体片段之前奏曲 ———小分子抗体
第一代小分子抗体———抗原结合片段 ( fragment with antigen binding，Fab) 和重组Fab • Fab 片段由完整轻链和重链的VH + CH1构成，
其大小为完整抗体的1/3,约55KD；
• 3）具有更强的杀伤淋巴瘤细胞的功效，且对同体正
常B 细胞的作用较弱：Rossi 等报道了一对来自抗 CD20 IgG1κ)和依帕珠单抗( epratuzumab ) 的人源 化6 价抗CD20 /22 的BsAb———20-22 和22-20。 它们无需第二抗体交联即可诱导肿瘤细胞凋亡和增殖
抑制
2.小分子抗体与其他分子连接 成融合物
与毒素的连接
• 将抗体片段与细菌或植物毒素连接, 使其具有特异性
的识别肿瘤细胞的功能, 并利用毒素来杀伤肿瘤细胞； • 如Di Paolo等曾将人源化的抗Ep一CAM的单链抗体 4D5MOCB与绿脓假单胞外毒素A融合, 发现其优先定 位在Ep一CAM阳性的肿瘤细胞, 并能抑制多种肿瘤在 裸鼠体内的生长, 显示了良好的应用前景。
与细胞因子连接
• 将抗体片段与IL-2、 IL-12或GM一CSF
等免疫刺激因子结合成融合蛋白后, 能刺
激细胞增殖, 能促使自然杀伤细胞产生溶
瘤细胞作用;
其他形式的免疫结合物
1）放射性标记的抗体片段：，通过抗体特异性的识别作
用使放射性物质有效地导向肿瘤组织局部，用于放射 免疫治疗; 2）抗体-化疗药物结合物：通过化学方法使抗体和化疗 药物的某些基团偶联，在特异的作用位点产生细胞毒
作用进行免疫化疗;
3）抗体-酶连接物：利用抗体导向作用，将催化 前体药物的酶携带至肿瘤局部，待血液循环及 正常组织中非特异分布的抗体酶药物廓清后再 注射前体药物，在肿瘤局部造成高浓度化疗药 物的微环境，从而高效率杀伤肿瘤细胞。
4. 细胞内抗体
• 将小分子抗体基因加上定位信号序列，使其在
细胞内特定部位表达，可中和或调节位于特定
纳米抗体单域的性质
• 1）有高度水溶性和构象稳定性：尽管缺失轻
链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力。 并且由于在框架FR2 区存在一些不同于常规抗 体的亲水性氨基酸，使得VHH 抗体在水溶液 中具有良好的稳定性。
• 在苛刻的条件中，如胃液和内脏中仍能保ห้องสมุดไป่ตู้抗
原结合活性，为口服治疗胃肠道功能紊乱性疾
病提供新的思路；
• 2）纳米抗体能识别独特的抗原表位，由于具有 伸展的抗原互补结合区( CDR) 以及更高的组织 穿透性和更小的分子，VHH抗体可以结合一些 常规抗体无法接近的抗原表位。可进入酶的活 性部位及细菌或病毒表面受体裂缝中，可以利 用其模拟药物来设计小分子酶的抑制剂、受体 的激动剂或拮抗剂等； • 3）能有效地穿过血脑屏障：有望成为治疗神经 性疾病和脑肿瘤的新药
VHH稳定的机制
• 传统抗体的VH 和VL 区通过疏水作用形成稳
定结构，而重链抗体则通过选择性突变VHH
胚系基因中几个功能位点，使其形成较高的亲
水性表面，可在缺失VL 条件下保持结构稳定；
VHH 胚系基因序列特性
• 1）对骆驼VHH 胚系基因序列分析发现，
VHH 与人源VH 基因Ⅲ家族序列具有较