慢性染铅大鼠皮层NOS和nNOS神经元数量的变化

基金项目:国家自然科学基金(39870689)

作者简介:黄　芬,女,1979年出生。本科学历,医生。主要从事外科临床工作。

慢性染铅大鼠皮层NOS 和n NOS 神经元数量的变化

黄　芬1　李积胜2　杨　烽2　陈　俊2　王华仁2　高　云2

(1武警西藏总队医院外一科,拉萨850003;2武警医学院军事预防医学研究所,天津300162)

摘　要　目的　探讨铅损害大鼠大脑皮层一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase ,NOS )和神经元型一氧化氮合酶(Neural nitric

oxide synthase ,nNOS )阳性神经元的作用机制。方法　采用NADPH -d 组织化学和nNOS 免疫组织化学方法,研究饮用含不同剂

量醋酸铅(0.02,0.2g/L )饮水的大鼠皮层NOS 和nNOS 阳性神经元数量的变化。结果　铅染毒大鼠皮层NOS 和nNOS 阳性神经元的数量明显减少。结论　铅对大脑皮层NOS 和nNOS 阳性神经元有明显的损伤作用,并且存在明显的剂量-效应关系。

关键词　铅　皮层　一氧化氮合酶　神经元型一氧化氮合酶

Ch anges in number of N OS and nN OS positive neurons in cortex of chronically lead exposed rats

HUANG Fen ,LI Jisheng ,YANG Feng ,CHEN Jun ,WANG H u aren ,and G AO Yun.Tibetan Autonomous R egional Corps H ospi 2tal ,Chinese People ’s Armed Police Forces ,Lh asa 850003,China

Abstract Objective T o study the effect of lead on NOS and nNOS positive neurons in rat cortex and its mechanisms.Methods NADPH 2d histochemistry and nNOS immunohistochemistry were used to study the changes in number of NOS and nNOS positive neurons in cor 2tex of rats which had drunk water containing different doses of lead acetate (0.02,0.2g/L ).R esults The NOS and nNOS positive neurons in lead exposed rats ’cortex decreased in number significantly.Conclusion Lead brings about harm ful effects on NOS and nNOS positive neurons in rat cortex in a dose 2dependent manner.

K ey w ords Lead C ortex Nitric oxide synthase Neural nifric oxide synthase

铅(Lead ,Pb )是一种非人体必需元素,任何水平

的Pb 暴露都会对中枢神经系统尤其是脑发育造成损害。大脑皮层是Pb 神经毒性作用的敏感部位。本实验利用组织化学和免疫组织化学实验方法研究Pb 对大鼠皮层NADPH -d 、nNOS 阳性神经元数量的影响,为揭示Pb 对大脑皮层NOS 和nNOS 阳性神经元的损害机制提供一定的实验依据,并观察其剂量-效应关系,为开发合理有效的排Pb 药物提供重要实验依据。

1　材料和方法

1.1　动物分组及饲喂方法　Wistar 大鼠购自天津

市实验动物中心。选用健康刚断乳(出生后21d )

wistar 大鼠30只,随机分为对照组(单蒸水,普通饲料),低铅组(0.02g/L 含铅饮水,普通饲料),高铅组(0.2g/L 含铅饮水,普通饲料)。每组10只大鼠,喂养90d 。1.2　动物、饲料、主要试剂及实验设备　1.2.1　饲料及饮水　含铅水由醋酸铅(Pb (CH 3C O O )2・3H 2O )(分析纯,天津市化学试剂三厂)及单蒸水配制而成,普通饲料由天津市军粮城动物饲料加工厂加工制成。

1.2.2　主要实验试剂　NADPH -Ⅱ(Sigma ),氯化

硝基四氮唑蓝(NBT )(Sigma )。兔抗鼠神经元型一氧

化氮合酶(nNOS )抗体(Santa Cruz Inc ),ABC 药盒(Vector laboratories Inc ),二氨基联苯胺(DAB )(Sigma ,U.S.A ),Triton x -100(R ohm -Hass 进口分装),多

聚甲醛(上海溶剂厂)。

1.2.3　主要仪器　恒冷箱切片机(S ANY AN ),摄影

显微镜(Nikon ),磁力加热搅拌器(上海制造),高压消毒锅(山东制造),电子天平(江苏制造)。

1.3　实验方法

1.3.1　组织的制备　每组的10只大鼠经0.4%戊

巴比妥纳腹腔麻醉后,剪开胸腔,暴露心脏,从心尖插入灌注针至左心室,并剪开右心耳形成灌注液排除通道,从左心室快速灌注生理盐水100～150ml ,至流出液清亮,肠系膜颜色苍白,肝脏颜色变为淡黄色,此时接着灌入4℃的4%多聚甲醛500ml ,于30～40min 灌毕,至大鼠躯干、四肢僵直,肝脏变硬,迅速取脑置4℃的4%多聚甲醛固定液中后固定6～9h ,10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脱水。将右侧海马

置恒冷箱冰冻切片机内冰冻切片(片厚约50μm ),pH 7.4的0.01m ol/L P BS 接片后进行NADPH -d 组

化染色和nNOS 免疫组化染色。

1.3.2　NADPH -d 组化染色　切片移入NADPH -

d 反应液,37℃孵育1h 。裱片、脱水、透明、封片。