2011CB965000-G三维培养干细胞自我更新与定向分化的调控网络

项目名称：三维培养干细胞自我更新与定向分化的

调控网络

首席科学家：戴建武中国科学院遗传与发育生物学

研究所

起止年限：2011.1至2015.8

依托部门：中国科学院

二、预期目标

本项目的总体目标：

通过本项目的实施，建立干细胞三维培养和完善干细胞纳米示踪技术，解析干细胞自我更新与分化过程中遗传与表观遗传的调控网络，为干细胞的应用奠定基础。取得一批具有重大影响的科研成果，提高我国在干细胞研究领域的自主创新能力。

五年预期目标:

1．综合考虑多种因素，最大限度模拟体内环境，制备出适合干细胞生长分化的三维支架材料，建立三维培养多能干细胞和成体干细胞的自我更新和定向分化的研究体系。

2. 结合基因组、蛋白质组和磷酸蛋白质组分析结果探讨三维培养条件下干细胞自我更新和定向分化的分子和细胞机制，阐明在干细胞自我更新和定向分化中起关键调控作用的信号通路和信号网络、转录调控以及表观遗传调控网络。

3．通过模式动物体内干细胞维持与定向分化研究，发现并鉴定与神经干细胞的维持、分化相关的一些新基因，阐明其作用机制。明确体外三维培养的神经干细胞在体内的自我更新能力与分化潜能，并对其导入体内后的有效性、安全性进行评估。分析三维培养干细胞与体内干细胞维持与分化机制的异同，获得干细胞调控的真实信息。

4. 建立干细胞纳米示踪与成像新技术，包括制备出高生物相容性、高量子产率的量子点，建立量子点标记活细胞及亚细胞组分的方法，实现对三维培养干细胞以及活体干细胞的特异性标记，建立三维培养干细胞和活体干细胞的三维、非损伤性的纳米示踪与成像技术。

5．培养研究生30名。博士后10名。

6．在本领域发表论文30篇，其中影响因子5以上的15篇。

三、研究方案

1）学术思路：

干细胞的自我更新和定向分化是干细胞研究中的基本问题。在体内，干细胞的自我更新和分化是处于三维环境中，体外三维培养体系下细胞的行为学特性近似于体内细胞的特性。本项目将建立模拟体内环境的干细胞三维培养体系，并利用干细胞纳米标记与成像技术，研究三维培养干细胞自我更新和定向分化的调控网络。在体内研究中，以线虫和小鼠为模式动物，系统研究体内干细胞的维持、分化调控机制。

2）技术途径：

根据研究内容，本项目技术途径如图所示：

具体内容如下：

1）适合不同类型干细胞培养的三维胶原支架的构建

分离纯化胶原蛋白，制备三维胶原支架材料，检测其生物相容性，运用不同生产工艺使其具有适宜的硬度和孔隙结构，建立适合不同类型干细胞培养的三维

支架材料。

2）三维胶原支架材料的修饰、优化

在胶原支架材料的基础上，将微环境中调控干细胞自我更新和定向分化的其它细胞外基质成份、信号分子或支持细胞等因素通过不同的方法整合到胶原支架材料上，对三维胶原支架材料进行修饰优化，以最大限度的模拟体内干细胞自我更新和定向分化的环境。

3）干细胞三维培养体系的建立

干细胞选择多潜能干细胞（ES细胞和iPS细胞）和成体干细胞（神经干细胞、心肌干细胞、骨骼肌干细胞）。

（1）用纳米量子点-荧光标记结合活细胞成像技术记录和追踪经干细胞诱导分化的神经细胞在三维培养介质中的粘附、生长、迁移和运动等动态行为。

在亚细胞水平用活体成像技术观测参与调控细胞行为的细胞骨架(如actin 或 tubulin的荧光融合蛋白)及其他因子的动态变化。

（2）将不同干细胞接种于适宜的三维胶原支架材料，与二维培养体系相比较，利用芯片技术对二者基因表达情况进行比较，分析在三维培养条件下干细胞的基因表达情况，利用western blot等技术对关键因子的蛋白表达进行定量分析。综合利用细胞生物学和分子生物学的方法对两种培养体系下细胞的干细胞特性进行比较。

4）干细胞自我更新调控机制研究

（1）将干细胞接种于适宜的三维胶原支架材料，进行自我更新和定向分化研究。分离提取细胞RNA用Q-PCR检测干细胞及分化细胞标志蛋白以及调节干细胞定向分化的关键转录因子的表达，分离提取细胞总蛋白检测干细胞及分化细胞标志蛋白表达水平。用针对integrin等细胞表面标记以及细胞骨架蛋白的特异性抗体，通过免疫荧光染色比较二维和三维环境中干细胞及其定向分化细胞的细胞形态、粘附特性及运动特性。

（2）三维培养干细胞的发育潜能研究，在建立胚胎干细胞三维培养体系的基础上，探索三维培养胚胎干细胞的发育潜能，体外研究中重点探索三维胚胎干细胞向神经、心肌等细胞分化的能力及其调控机制，体内利用嵌合以及四倍体补偿等方法鉴定三维培养的胚胎干细胞体内发育潜能及细胞多能性。

（3）以生物化学方法检测三维培养环境中干细胞的自我更新和分化受外界信号调控的各种信号转导通路的动态变化，并与通过细胞生物学手段检测信号通路中各组分激活状态的亚细胞分布相结合，检测其下游靶基因的表达水平，以分析细胞中各种信号通路的整合情况，解析干细胞对于不同培养条件作出反应的分子基础。其中自我更新研究将以ES细胞和iPS细胞为主，探讨其以Oct4和Nanog为中心的干细胞自我更新的调控网络。

5）干细胞定向分化调控机制研究

（1）选择成体干细胞包括神经、心肌和成肌干细胞，将干细胞接种于三维支架材料上，检测比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞分化过程中的细胞学特性，包括细胞形态变化、标志蛋白表达及细胞功能等。

将干细胞接种于适宜的三维胶原支架材料，进行定向分化研究。通过细胞形态观察及免疫荧光染色检测干细胞定向诱导分化后产生的细胞类型（针对神经干细胞分化产生的细胞类型将分别用神经元、星形胶质细胞及寡树突细胞标志蛋白的特异抗体（神经元TuJ1及MAP2，星形胶质细胞GFAP，寡树突细胞OSP）作免疫荧光染色, 针对人胚胎干细胞分化产生的心肌细胞类型将分别用α-肌浆球蛋白重链（α-MHC）、肌钙蛋白C、心房利钠肽（ANP）等标志蛋白的特异抗体作免疫荧光染色,骨骼肌标志蛋白MHC和Caveolin-3）。例如肌原代成肌细胞或肌源性细胞系C2C12细胞在增殖阶段的培养条件为含10%胎牛血清的DMEM培养基，诱导分化的培养条件为含2%马血清的DMEM培养基，一般5～6天细胞可以分化成肌管。针对成肌干细胞分化产生的骨骼肌细胞将分别用骨骼肌标志蛋白MHC和Caveolin-3作免疫荧光染色。分离提取细胞RNA用Q-PCR检测干细胞及分化细胞标志蛋白以及调节干细胞分化的关键转录因子的表达，分离提取细胞总蛋白检测干细胞及分化细胞标志蛋白表达水平。检测并比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞在分化过程中亚细胞结构水平的变化，用针对integrin等细胞表面标记以及细胞骨架蛋白的特异性抗体，通过免疫荧光染色比较二维和三维环境中干细胞及其定向分化细胞的细胞形态、粘附特性及运动特性。通过与课题组四合作，用纳米量子点-荧光标记结合活细胞成像技术记录和追踪经干细胞诱导分化的神经细胞在三维培养介质中的粘附、生长、迁移和运