植物原生质体培养及细胞融合过程

2. 原生质体是各种遗传操作的理想受体， 从而可以进行品种的遗传改良。 可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒， 为高等植物的遗传饰变打下基础。
3. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
植物原生质体培养及细胞融合过程
第一节 原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离
（一）材料来源
植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织 以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料。
果胶酶/纤维素酶 纯度高， 但浓度不来自太高； 木本植物加入半纤维素酶。
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◆渗透稳定剂
如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩， 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽， 但同时也可能抑制原生质体的分裂。
①糖溶液系统
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；
②盐溶液系统
包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，
提高原生质体的稳定性植物；原使生质R体培N养A及酶细胞不融合活过程化；并使离子稳定。
细胞壁的组成
纤维素 半纤维素 果胶质
25-50％ 53％
5％
纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶
少量蛋白质
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酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有 纤维素酶C，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用， 还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素， 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等，
目前较多采用叶片分离原生质体， 但分裂旺盛的、再分化能力强的愈伤组织或悬浮细胞系， 尤其是胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系 是最理想的原生质体分离植材物原料生质。体培养及细胞融合过程
材料预处理
意义
▲提高原生质体的分裂频率； ▲逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。
方法 ◆暗处理
豌豆枝条取下后，分离原生质体前，先在黑暗中（一定湿度）放1-2d， 提高原生质体存活率高，并能继续分裂；
◆pH
酶溶液的pH值 对原生质体的产量和生活力影响很大。
用菜豆叶片作培养材料时发现
原始pH值为5.0时，原生质体产生得很快， 但损坏较严重，并且培养后大量破裂。
当pH值提高到6.0时，最初原生质体却产生少， 但与pH值为5.0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。
原始pH值提高到7.0时， 生活的原生质体数量进一步增加， 损伤的原生质体也少得多。
◆预培养
羽衣甘蓝先去叶下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，再去壁， 原生质体高度液泡化，叶绿体也解体；
◆低温处理
龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理后，分离得到的原生质体才能分裂。
（在很多情况下植材物原料生质体不培养必及细经胞融合过过程专门的预处理）
（二）原生质体分离方法
1. 机械法
Klercker于1892年最早进行分离高等植物原生质体的研究。
2. 酶分离法
1960年， Cocking首先利用纤维素酶处理番茄根尖， 分离得到收率高、活力强、完整性好的原生质体。
1968年， 纤维素酶和离析酶商品化生产后， 大量进行植物原生质体的研究。
现在
果胶酶处理 → 单细胞－－纤维素酶处理 → 原生质体
分离原生质体最有效方法。
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④
吸掉酶液
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二、原生质体的纯化与活力测定
（一）原生质体的纯化
1. 沉降法（过滤离心法）-应用最广
利用比重原理，低速离心使原生质体沉于底部。
过滤酶处理混合液，30-40µm微孔滤膜， 低速离心，150g以下，3-5min，弃上清， 用液体培养基或甘露醇溶液悬浮洗涤， 重复2-3次， 1-2ml液体培养基悬浮原生质体，备用。
优点：操作方便；损失少。
缺点：纯度不高
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2. 漂浮法
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分离叶肉原生质体的完整流程
表面灭菌的叶片 ①撕去下表皮 酶溶液及渗压稳定剂 ②抽真空、振荡 原生质体沉于培养皿底
（叶段漂浮其上）
保温8hr
③
⑤离心2次，
原生质体
原 生
第2次离心前重新悬浮于高蔗糖清洗液中 悬浮于清洗液中
质
体
（
上
层
⑥重新悬浮于培养基中
以适当的植板密度
）
取少量样品用血球板计数 重新悬浮于培养基中
日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用。
◆一步分离法 一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理。
上海植物生理研究所生产的ZA3-867纤维酶是多种酶的复合物， 含有纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。
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酶液的配制 ◆酶的配比和浓度
原生质体（protoplast）
植物细胞中除去细胞壁的裸露的有生活力的部分。 除了没有细胞壁外，具有细胞的一切特征。
原生质体包括
▲ 细胞质膜 ▲ 膜内细胞质 ▲ 其他具有生命活性的细胞器，
如细胞核、线粒体和高尔基体等。
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原生质体培养意义
是植物细胞工程的核心技术。
1. 除去了细胞壁， 为植物细胞之间的融合扫平了障碍， 实现体细胞杂交，为制造新杂种开辟了道路。 (克服远缘杂交不亲和性)
其方法是把细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞发生质壁分离， 原生质体收缩成球形，然后用利刃切割，
发生质壁分离的细胞壁被切去后释放出原生质体。
缺点
◆原生质体的产量低； ◆方法繁琐费力； ◆对分生细胞和其它液泡化程度不高的细胞不适用。
未得到广泛应用。
优点
能够排除外加酶对离体原生植质物原体生的质体结培养构及细和胞融代合过谢程活性的有害影响。
总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。
◆ 半纤维素酶 降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。
◆ 果胶酶 使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。
此外，还有蜗牛酶（主要用于花粉母细胞和四分体细胞）等。 植物原生质体培养及细胞融合过程
原生质体酶分离法
◆两步分离法 用果胶酶离析植物组织，收集细胞； 经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，然后获得原生质体。