LPS致大鼠发热过程中下丘脑TRPV4对体温及cAMP含量、[Ca2+]i浓度的影响

在LPS致大鼠发热过程中下丘脑TRPV4对体温及cAMP含量、［Ca2＋］i浓度的影响1

王兰兰，王乐，曹宇*

中国医科大学基础医学院生理学教研室,沈阳（110001)

E-mail：caoy5955@

摘要：目的探讨TRPV4在发热时是否参与体温调节过程。方法用脂多糖复制大鼠发热模型，结合应用钌红抑制TRPV4的活性，观察发热时的下丘脑组织中TRPV4含量、钙离子浓度变化与cAMP含量的关系。结果单独给予钌红组体温降低，钌红＋LPS组与LPS组△、cAMP与［Ca2＋］i增高幅度均降低，钌红组与钌红＋LPS组TRPV4表达明显相比，T

低于对照组。结论 1.TRPV4通道可能参与正常体温的维持；2. LPS致大鼠发热可能是通过激活TRPV4通道，使钙离子内流增多，进而中枢发热介质cAMP表达增多，从而引起体温升高来实现的。

关键词：发热；TRPV4；脂多糖；环磷酸腺苷；［Ca2＋］i

近年研究认为，cAMP是EP性发热的主要中枢介质，此外下丘脑中钙离子的浓度变化在发热中所起的作用也日益受到关注，但具体机制还不清楚。

TRPV4是瞬时感受器电位香草酸受体家族的成员之一，能被27℃以上的温热刺激激活[1],是一个非选择性阳离子通道，被激活时可产生一个较大的钙离子内流[2、3]。研究发现TRPV4在下丘脑前部表达较多[4]，这一区域是主要的体温调节中枢，表明TRPV4可能在体温调节中起一定作用。

本实验通过用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）复制大鼠发热模型，结合应用钌红（ruthenium red，RR）抑制TRPV4的活性，观察发热时下丘脑组织中TRPV4含量、钙离子浓度变化与cAMP含量的关系，以探讨TRPV4在发热时是否参与体温调节过程。

1.材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康♂ SD大鼠,体重200～250 g,由中国医科大学实验动物中心提供,室温(22 ±2) ℃,昼夜明暗节律12 h ∶12 h,基础体温(3715 ±110) ℃,单笼饲养,自由进食水。实验所用试剂均用无热源生理盐水稀释。

实验前对大鼠进行测温服习7 d。测量体温时将温度探头插入大鼠直肠6 cm处,待数值稳定后读数,以给药前1 h测得的3次直肠温的平均值为大鼠基础体温。实验过程中记录大鼠体温(0～1 h内每隔15 min, 1～2 h内每隔30 min, 2～8 h内每隔60 min测量1次) 。实验结束后检查插管位置,舍掉位置不正确的数据。

实验分组：将48只大鼠随机分成4组，每组12只。对照组（N）：向侧脑室注入NS 10 µl，30 min后经腹腔注射NS 80 µg/Kg。钌红组（R）：方法同N组，分别注射相同剂量的RR(Sigma公司产品）和NS。LPS发热组（L）：方法同上，分别注射相同剂量的NS和LPS （武汉博士德公司产品）。钌红＋LPS组（R+L）：方法同上，分别注射相同剂量的RR和LPS。

上述各组中随机选取6只动物在腹腔注射生理盐水或LPS后240 min时断头取材，以备1本课题得到国家自然科学基金资助项目（No30270198）；高等学校博士学科点专项科研基金（No2006159004）的资助。

进行各种生化指标的检测。按大鼠脑图谱以灰结节和视交叉的中心点为界定部位，取出下丘脑组织，一部分立即进行细胞内钙离子浓度测定，一部分立即投入液氮中速冻固定，20 min 后放入－70℃冰箱内待测；另外6只动物持续观察480 min，并描绘其体温变化曲线。

1.2 侧脑室插管

将大鼠用10％水合氯醛（3 ml/kg)腹腔麻醉，然后将其头部固定于立体定位仪上，暴露前囟。参照大鼠脑图谱，用探针在颅骨表面冠状缝下1.5 mm，矢状缝旁开0.8 mm处钻孔，将外径为1 mm的引导管插入一侧侧脑室，用牙托水加牙科水泥固定导管。术后动物单笼饲养，恢复一周后进行实验。

1.3 下丘脑中cAMP含量的测定

取预存的下丘脑组织50 mg，加2 ml冰醋酸，进行匀浆，3000 r·min- 1离心15 min，取上清，在60℃水浴中用氮气将上清吹干，之后按照cAMP放免检测试剂盒（上海中医药大学同位素室提供）说明书进行测定。

1.4 采用Western blotting方法检测大鼠下丘脑组织TRPV4表达

取大鼠下丘脑组织，冰浴匀浆，4℃离心12 000 r·min- 1，15 min,取上清，再进行蛋白定量之后，进行电泳，转膜，封闭，加抗TRPV4抗体(Sigma公司产品) ，稀释倍数1∶200，二抗为羊抗兔IgG(武汉博士德公司产品) ，DAB显色。

1.5 下丘脑细胞内钙离子浓度测定

各实验组大鼠于发热高峰时立即断头取脑，1 min内取出新鲜下丘脑组织，立即置于4℃的D－Hanks液中剪碎并洗2～3次，后置于等体积，浓度为0.25%的胰酶中，37℃恒温水浴消化30 min，消化过程中轻轻吹打。加入4℃的D－Hanks 液(含10％的小牛血清) 3 ml终止消化，过200目筛网(至小烧杯内)，滤液以800 r·min- 1离心2次，每次5 min，弃上清，沉淀物中加D －Hanks液2 ml。台盼蓝排斥实验检查，细胞存活率须在95%以上，并调整细胞数为(106～107 ·ml- 1 ) 。Fura2 /AM用纯二甲基亚砜(DMSO)配成50µg·mL - 1的储备液，- 20℃保存备用。

取上述细胞悬液1 ml，预温5 min后，加入5µl Fura2 /AM ，37℃恒温避光孵育负载45 min，负载后细胞用D－Hanks液洗2次，以1000 r·min- 1离心2次，每次5 min，弃上清，加入D－Hanks 液定容至1 ml。

采用日立F3 000型荧光双波长分光光度计测定，激发波长为340 nm、380 nm，发射波长为510 nm。根据下面公式可计算[ Ca2 + ] i。[Ca2 + ]i = Kd ×(R - Rmin ) / (Rmax - R ) ×F2min /F2max( nmol·L - 1 ) 。Kd 值为224 nmol·L - 1 , R 为荧光值, [ Ca2 + ] i 为nmol·L - 1。F2 min为加入EGTA 后测得的荧光值,，F2 max为加入TritonX－100后测得的荧光值[5]。

1.6 统计学处理

采用SPSS13.0软件进行统计学分析，所有实验数据均用均数±标准差（x±s）表示，各组均数间差异性的比较用t检验，相关分析用相关性检验分析法。

2. 结果

2.1各实验组大鼠的体温变化