植物遗传工程 二、突变和突变体的筛选
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遗传 Ｈ ＲＤＴ Ｓ ｅｉ ） （） ＥＥ ＩＡ （ ｉ ｇ ４４＂ Ｂｊ ｎ
３９－ ４１ １９Ｒ２
植
物
遗
传
工
程
二、突变和突变体的筛选
彼 ・ 尔 得 卡 进
（ 美国密执安州立大学土壤和作物科学系 ）
植物细胞和植物系统的突变体可以分为两大类：
一类 是可 用选择系统 回收 的突变体 ；一类是不 能用选 择系统回收 的自发突变体。 这里 ， 们只讨论第一类。 我 在细 菌中，可以利用正选 择系统和负选 择系统 回收突
再者 ，所用 的正选 择系统的类９还决定 着突变 休 ｝ ｌ ｉ 的性 质。 用一步选择 系统得到的突变体一般 是单基 因 突变。在 细菌中 ， 单基因缺陷 多为隐 性突变 ， 而且按 孟 德尔定律 传递。 在植 物细胞中 ， 抗代谢物 「 例如 ， 甲基 弓 一 色氨酸 、 蛋氨酸 磺酸亚胺 （ ｅ ｉ ｉ ｓ ｆ ｉｉｅ， ｍ ｔ ｏ ｎ ｕ ｏ ｍｎ） Ｓ ｈ ｎ ｅ ｘ ｌ － 氨 乙基半 眺氨酸 等〕和抗［ 素抗性突变休也是很好 的 Ｍ ｆ ｌ 例 子，它 们都是 用一 步选择系统得到 的单基 因隐性 突 变。 在植 物中， 多步选 择的例子很 少， 但很有趣 ｏ ｏ Ｎ ｂｒ ａ ｓ 用多步选择获得了抗氯 化钠 的烟草细袍 系和植株。他 先用低浓 度氯化钠使 。％ 的悬浮细 胞的生长受 到 抑 ０ 制 ． 出能够生长约细胞 ， 选 然后再依次 增加盐浓度 ， 进 行多次选择 ， 最后得到了耐盐 的细胞系和再生植株 。 业 已证明 ，多步选择系 统对于那些生化 背景不 详但可能 颇为复杂的突变体 的获 得，颇为有效 ，因此 可用于 抗 盐 、抗低温和抗旱等突 变体的筛选。 多步选择得到 的 突 变体， 不是 由于单基因 的变 化， 而是 由于多基 因的变 化， 因此需要更多的步骤 ， 以便 发生更多的突变事件 ， 从 而使有 关 的各基 因在 所处的环境 中逐步发挥 功能。 多步选择系 统还有 一个更令人感兴趣 的优点，即 可 以增加特定基 因的拷 贝数。 在动植物任何 特定组 织 中，某种蛋 白质 的总量 决定于 细胞内该蛋 白质编码基 因的拷贝数。因此 ，可 以用增加特异 基因拷 贝数的方 法 提高细 胞中相应蛋 白质的含量 ，例如特异地增加胚
Ｐ ｔｒ ｅｅ Ｓ． ｒｓ ： Ｃａ ｌｏｎ Ｐ ａ ｔ Ｇｅ ｅｉ ｌｎ ｎ ｔｃ Ｅｎ ｉ ｅ ｒｎ ｇ ｎ ｅ ｉｇ
１． ｕ ａｉ ｎ ｎ Ｓ ｌｃｉ ｎ ｆ ｕａ ｓ １ Ｍ ｔｔｏ ａ ｄ ｅｅ ｔｏ ｏ Ｍ ｔｎｔ
３９
量 也提高了 １ ２倍。另一个巧妙的关键是 ，他还 用睬 酶抑制剂－ ）基腺进一步选择脉酶含量更高的突变 － ！ Ｉ 体。经基腺是一种活性位点抑制剂，它可 以和脉酶的
乳中高营养蛋白的含量， 这当然非常！ 有用。Ｐｌｃ ｏｃ ａｏ和
Ｆｌ ｉｅ ｎｒ都作过脉酶突变 体的研究。 现 以 Ｆｌ ｒ 关于 ｉｅ ｎ 烟草高腺酶细胞突变 体的筛选为例 ， 说明这一问题 。 烟 草 细胞可 以利用尿素作 为唯一氮源 ， 但效率不高 ， 所以 在 烟草的标准培 养基 中都以硝酸铁 作氮源。以细胞总 量对培养 时间作 图便 可得到细胞生 长曲线。在总氮量 相同但氮源不 同 （ 硝酸 按和尿素） 的两种培 养基 中， 细 胞 的生长 曲线也不 同。 但是，Ｆ ｎｒ选到 了在 两种培 ｉｅ ｌ 养基 上生长得同样好 的突变细胞系 ，发 现这 些细胞在 尿 素中的生长速 度提高 了 １ 倍，这 暗示出脉酶 的 含 ２
这种方法使细胞中腺酶的含量提高了５ 倍。 这一结 ０
果 有两种可能的解释：一是 由于调控水平 的变化使转 录 和翻译产物增加 ， 而结构基因的数量不变； 一是结构 基因的拷 贝数增多。也可能二者 兼 有。 为 弄 清 其机 制， 须找 出编码腺酶的 ｍ Ｎ 。实验程序如下：首先 ＲＡ 制备腺酶 的抗体 ， 然后取产生脉酶的细胞培养物， 收集 多核糖体 ，这些多核糖体产 生的多肤与加人的脉酶抗 体发生沉 集反应 ， 从这些沉淀复合物中回收 ｍ Ｎ ， 再 ＲＡ ｍＮ Ｒ Ａ在逆转 录酶作 用下产生 出 ｃＮ ， Ｄ Ａ 把这种 ｃＮ ＤＡ 作成标记探针 ，用以寻求烟草细 胞中相应 基因 的拷贝 数， 即与从出发细胞和腺酶活性提高 ５ 倍 的细胞 中分 ０ 离出的总 Ｄ Ａ 进行分子杂 交。结果发现 ，出发细胞 Ｎ 的 杂交活性若为 １ 单位， 突变细胞则为 ３－４ 单位。 ０ ０ 这表明， 突变主要是 由于 基因拷 贝数的增加， 但也不排 除 调控系统的变化。如果能用这种方法 提高大豆 中腺 酶 蛋白质的含 量， 就会增加其 营养价值。然而， 里有 这 两个问题 ：一是此实验是用烟草作的，不一定适合于 大豆； 二是烟草突变细胞系一般不易再生成完整植株 。 但 不管怎样 ， 增加基因的拷 贝数仍然是很重要 的， 因为 在 选择中基因仍然保持完整 ，所产生的蛋白质 的一级 结构没有变化， 即只是提高了基 因的表达水平， 没有 而 破坏发育中的调控系统 ， 这一点对于育种很有意义。 更 为有趣的例子是 Ｓｉ 。 在 哺乳动物中所用的类 似的 ｈｅ ｐ 筛选系统。他 用二氢叶酸还原酶 （ Ｈ Ｒ 活性位 点抑 Ｄ Ｆ） 制 剂氨甲喋吟 ， 选出了高 Ｄ Ｆ 突变体，经十几 年的 ＨＲ 努 力， 使基因组中 Ｄ Ｆ 基因的拷贝数提高了一 万多 ＨＲ 倍。即使对于动物 ， 这也很有 意义 ， 这样便可以把基因 剂 量增加到在 染色体上可见的程度。他 发现染色体发 生 了重要变化：首先含 Ｄ Ｆ Ｈ Ｒ基 因的染色体增加了， 第二个变化更为有趣 ， 即出现 了一条 只含 Ｄ Ｆ 基因 ＨＲ 的额外的小染色体。 这暗示 出， 在高等生物中 ， 特殊 在 情 况下 ，有可能创造 出含有令人感兴趣的遗传 物质的 新染色体。此点对于 高等植物系统可能很有价值。
生 的体细胞重组。已知，体细胞重组可 发生于果 蝇和 真菌 ，而且可以被某些物理和化学诱变剂所诱 发。现 在 看看在植物中体细胞重组如何造成基因拷贝数的变 积 。作箱物 中休细胞重组发 生 在 Ｄ 人 复制后的 Ｇ Ｎ ２
基 因 拷 贝 数 发生 的机 制 可 能 是 有 丝 分 裂过统对感兴趣的发
育组织或区域进行筛选 的例子。业 已证明，此法对坑 病原菌毒素和抗病毒 突变体 的选择也是有效的。 最后再讲讲负选择系统。在植物 中除 Ｐｌ ｃ 所 ｏｃ ａｏ 用的负选择系统外， 还有两种重要的负选择系统 ， ５ 即 － 滇脱氧尿苔 （ｒＵｄ Ｂｄ ｒ） 系统和 高氯酸盐系统。 Ｂｄ ｒ ｒ ｄ Ｕ 系统的基础是 ，合成 Ｄ Ａ 的细胞才能生长 ，不合 成 Ｎ Ｄ Ａ 的细胞不生长 ，生长的细胞可将有 毒的 Ｂｄ ｒ Ｎ ｒ ｄ Ｕ
选 择 系统 。
变体； 在植物系统中， 情况也如此。
首先讲 正选择系统。 所谓正选择系统 ，系指在培
养基中加入某种对正常细胞有毒的化学物质，从而使
正常细胞不能生一而突 变体却可生长 的系统。它又可 长 以分 为两种 ：一 种是一步选择系统 ，即 只需通过一步 选择 ， 便可 筛选出突变体 ； 一种是 多步选择系统 ， 即通 过多步连续 选择才能筛选 出突变体。这 两种不 同的选 择系统可 以筛选出不同类型 的突变 体。现在 以植物悬 浮细胞培养 物的生长为例 ，着一 下这两种选择 系统 的 差别。 以悬 浮细胞生长数量对培 养时间作图 ，得 出其 生长 曲线。 细胞接种后经 过一 段滞缓期开始分 裂， 此 后细 胞数 量随 着培养时间 的延长 而增加 ，最后达到最 大值。平皿培 养细胞也如此。这种稳 定的生长型是在 不加有毒物 质时 （ 即有毒物 质的处理时间为零 ）得到 的。现在 看看加人有毒物 质（ 例如抗菌素 、 抗代谢物或 盐类 ） 后的情况。在 毒素剂量较低时 ， 滞缓期延长 ， 细 胞分 裂速 度放慢，细胞数量的最 大值降 低。毒素的剂 量不 同（ 例如 相对剂 量为 １ 单位 ， ０ １ 单位 、 ０ 单位或 １０ 更高）生长曲线也不同。根据这一 原理 ，便可选 出突 ， 变 细胞。 对于 一步选择系统来说 ， 加人的毒素剂 量应 当 较 高（ 例如 １０ ０ 单位） ，此 时未发 生突变的正常细胞不 能生 长，只有突变细胞才能生长。 对于 多步选 择系统 来说 ， 在低剂 量毒素的条件下， 养物的生长速度非常 培 缓慢 ，在 相 当长 的时间 内只有最 小量的细胞生长或存 活下 来，因此可以选 择生长 最快 的细胞群体。这是两 者在 选择速度上 的差 别， 此外还有 另一些重要 区别 ： 一 步 选择只需一次实验 ，即在 高剂量毒素的培养基 中寻 找突 变体， 而不管突 变是否 发生 ； 多步选 择则需经过几 个不 同步骤 ， 步加人低剂量毒素 ， ９％ 的细胞 第一 使 ０ 不能 生长 ， 中选 出生长较好的细胞 ， 从 然后再 依次增加 毒 素剂量 ， 行第二 轮、 进 第三轮等 筛选。 简言之 ， 一步选 择 只需一次实验 ， 多步选择则需要数次。 迄今所知道的 抗逆 性性 状一般都有几个不 同的水平，故需应 用多步
期和有 丝分裂初期。 假设两条同源染色体 上的杂合 等
位基因Ａ和ａ 位于着丝粒附近，并在着丝粒部位发生
重组。在 有丝 分裂过程 中，这两条染色体的染色 单体 可以独 立地分开 ，一 条染色体 的一个着丝点可 以移到 另一条染 色体 的一个着丝点部位 ，一条染色 单体也到 另一染色 单体 的一极 ，于是便造成含有纯合等位基因 （ Ａ ａ）的新染 色体。 由于 交换不 很准确 ， Ａ ， ｓ 单基因的 休 细胞重组有时便会在有丝分裂过程中增加或减少基 因的拷 贝数。此外 ， 用某些诱变 剂（ 还可 例如 丝裂霉素 Ｃ 低剂量的紫外线或 二 ， 射线 照射） 提高植物体细胞重 组 频率。 因此 ， 用低剂量 的物理和化学诱变剂， 结合上 述 的选择 系统 ， 就有可能更有效地增加基因剂量。 现在讲正选择系统存在 的问题和解决途径。主要 问 题是 ， 许多重要基因在 细胞培养物 中不表达， 故无法 筛 选相应 的突变体 ，例如杭杀草剂的突变体。许多杀 草 剂只能杀死进行光合作用的细胞、而培养细胞的光 合作用极微弱 ，所以无法在 细胞培 养物的水平上区别 突 变体和非突变休。要选择这类突 变体 ，就必须把着 眼点放在完整植株上 。叶片的细胞群很象培养皿中的 细 胞，其 中某些部位的细胞也能发生突变。我们可以 用实验 的方法对叶片造成正选择压力 ， 然后 切下组织 上 可以区辨的突变部位 ， 行培养， 进 使之再生成植株， 借此便可选 出抗杀草剂的突变体。我们以烟草 为例说 明 这一过程。取烟草 单倍体植株 （ 温室内生 长的小植 株 ）以 ５０ 拉德剂量的 ｒ ， ０。 射线进行处理 ， 片中有些 叶 细胞可 能发生 了抗杀草剂毒劳定（ｉｏ ｍ） 变 ， ｐ ｌａ 的突 ｃｒ 但 我 们无法 区别每个细胞 ， 故应让植物继续生长， 直至长 出十片新 叶。在此期间每个突变细 胞发生分 裂而形成 由突变细胞组成 的小区 ，这样我们 便可以对一群细胞 进行选择， 而不是对单个细胞。此时喷以杀草剂， 敏感 细胞逐渐变成 浅绿 、 和白色 ， 黄色 最后死亡 ； 而抗性小 区仍然呈绿色。取下活的绿色小区， 进行培养， 使之再 生成完 整植株。再生植株的染色体可 能已经加倍 ，估 计这种二 倍休才具有抗杀草剂的抗性。这些植株有些 是抗杀草剂的， 但并非全部， 故尚须进一步选择。杀草 剂抗性性状是 由一 个或两个基 因控制 的，可以按照孟
活性位点结合， 使其不能再作用于尿素的氨基， 从而使 取酶失活。Ｆｎ 的方法是，在细胞培养塞中同时加 ｉ。 ｌ
人作为氮 源的尿素和经基腺，这样 ，一部分脉酶分子 由于活性位点被经基脉 占 而失活 ，要达到与无经基 据 脉时同样 的生长水平 ，就需要有 更多的腺酶分子 ，因 此， 在尿素加羚基腺的培养基中生 长速度与只有尿素 的培养基 中相 同的细胞，便会含有更多 的脉酶。他用
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二、突变和突变体的筛选
彼 ・ 尔 得 卡 进
（ 美国密执安州立大学土壤和作物科学系 ）
植物细胞和植物系统的突变体可以分为两大类：
一类 是可 用选择系统 回收 的突变体 ；一类是不 能用选 择系统回收 的自发突变体。 这里 ， 们只讨论第一类。 我 在细 菌中，可以利用正选 择系统和负选 择系统 回收突
再者 ，所用 的正选 择系统的类９还决定 着突变 休 ｝ ｌ ｉ 的性 质。 用一步选择 系统得到的突变体一般 是单基 因 突变。在 细菌中 ， 单基因缺陷 多为隐 性突变 ， 而且按 孟 德尔定律 传递。 在植 物细胞中 ， 抗代谢物 「 例如 ， 甲基 弓 一 色氨酸 、 蛋氨酸 磺酸亚胺 （ ｅ ｉ ｉ ｓ ｆ ｉｉｅ， ｍ ｔ ｏ ｎ ｕ ｏ ｍｎ） Ｓ ｈ ｎ ｅ ｘ ｌ － 氨 乙基半 眺氨酸 等〕和抗［ 素抗性突变休也是很好 的 Ｍ ｆ ｌ 例 子，它 们都是 用一 步选择系统得到 的单基 因隐性 突 变。 在植 物中， 多步选 择的例子很 少， 但很有趣 ｏ ｏ Ｎ ｂｒ ａ ｓ 用多步选择获得了抗氯 化钠 的烟草细袍 系和植株。他 先用低浓 度氯化钠使 。％ 的悬浮细 胞的生长受 到 抑 ０ 制 ． 出能够生长约细胞 ， 选 然后再依次 增加盐浓度 ， 进 行多次选择 ， 最后得到了耐盐 的细胞系和再生植株 。 业 已证明 ，多步选择系 统对于那些生化 背景不 详但可能 颇为复杂的突变体 的获 得，颇为有效 ，因此 可用于 抗 盐 、抗低温和抗旱等突 变体的筛选。 多步选择得到 的 突 变体， 不是 由于单基因 的变 化， 而是 由于多基 因的变 化， 因此需要更多的步骤 ， 以便 发生更多的突变事件 ， 从 而使有 关 的各基 因在 所处的环境 中逐步发挥 功能。 多步选择系 统还有 一个更令人感兴趣 的优点，即 可 以增加特定基 因的拷 贝数。 在动植物任何 特定组 织 中，某种蛋 白质 的总量 决定于 细胞内该蛋 白质编码基 因的拷贝数。因此 ，可 以用增加特异 基因拷 贝数的方 法 提高细 胞中相应蛋 白质的含量 ，例如特异地增加胚
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１． ｕ ａｉ ｎ ｎ Ｓ ｌｃｉ ｎ ｆ ｕａ ｓ １ Ｍ ｔｔｏ ａ ｄ ｅｅ ｔｏ ｏ Ｍ ｔｎｔ
３９
量 也提高了 １ ２倍。另一个巧妙的关键是 ，他还 用睬 酶抑制剂－ ）基腺进一步选择脉酶含量更高的突变 － ！ Ｉ 体。经基腺是一种活性位点抑制剂，它可 以和脉酶的
乳中高营养蛋白的含量， 这当然非常！ 有用。Ｐｌｃ ｏｃ ａｏ和
Ｆｌ ｉｅ ｎｒ都作过脉酶突变 体的研究。 现 以 Ｆｌ ｒ 关于 ｉｅ ｎ 烟草高腺酶细胞突变 体的筛选为例 ， 说明这一问题 。 烟 草 细胞可 以利用尿素作 为唯一氮源 ， 但效率不高 ， 所以 在 烟草的标准培 养基 中都以硝酸铁 作氮源。以细胞总 量对培养 时间作 图便 可得到细胞生 长曲线。在总氮量 相同但氮源不 同 （ 硝酸 按和尿素） 的两种培 养基 中， 细 胞 的生长 曲线也不 同。 但是，Ｆ ｎｒ选到 了在 两种培 ｉｅ ｌ 养基 上生长得同样好 的突变细胞系 ，发 现这 些细胞在 尿 素中的生长速 度提高 了 １ 倍，这 暗示出脉酶 的 含 ２
这种方法使细胞中腺酶的含量提高了５ 倍。 这一结 ０
果 有两种可能的解释：一是 由于调控水平 的变化使转 录 和翻译产物增加 ， 而结构基因的数量不变； 一是结构 基因的拷 贝数增多。也可能二者 兼 有。 为 弄 清 其机 制， 须找 出编码腺酶的 ｍ Ｎ 。实验程序如下：首先 ＲＡ 制备腺酶 的抗体 ， 然后取产生脉酶的细胞培养物， 收集 多核糖体 ，这些多核糖体产 生的多肤与加人的脉酶抗 体发生沉 集反应 ， 从这些沉淀复合物中回收 ｍ Ｎ ， 再 ＲＡ ｍＮ Ｒ Ａ在逆转 录酶作 用下产生 出 ｃＮ ， Ｄ Ａ 把这种 ｃＮ ＤＡ 作成标记探针 ，用以寻求烟草细 胞中相应 基因 的拷贝 数， 即与从出发细胞和腺酶活性提高 ５ 倍 的细胞 中分 ０ 离出的总 Ｄ Ａ 进行分子杂 交。结果发现 ，出发细胞 Ｎ 的 杂交活性若为 １ 单位， 突变细胞则为 ３－４ 单位。 ０ ０ 这表明， 突变主要是 由于 基因拷 贝数的增加， 但也不排 除 调控系统的变化。如果能用这种方法 提高大豆 中腺 酶 蛋白质的含 量， 就会增加其 营养价值。然而， 里有 这 两个问题 ：一是此实验是用烟草作的，不一定适合于 大豆； 二是烟草突变细胞系一般不易再生成完整植株 。 但 不管怎样 ， 增加基因的拷 贝数仍然是很重要 的， 因为 在 选择中基因仍然保持完整 ，所产生的蛋白质 的一级 结构没有变化， 即只是提高了基 因的表达水平， 没有 而 破坏发育中的调控系统 ， 这一点对于育种很有意义。 更 为有趣的例子是 Ｓｉ 。 在 哺乳动物中所用的类 似的 ｈｅ ｐ 筛选系统。他 用二氢叶酸还原酶 （ Ｈ Ｒ 活性位 点抑 Ｄ Ｆ） 制 剂氨甲喋吟 ， 选出了高 Ｄ Ｆ 突变体，经十几 年的 ＨＲ 努 力， 使基因组中 Ｄ Ｆ 基因的拷贝数提高了一 万多 ＨＲ 倍。即使对于动物 ， 这也很有 意义 ， 这样便可以把基因 剂 量增加到在 染色体上可见的程度。他 发现染色体发 生 了重要变化：首先含 Ｄ Ｆ Ｈ Ｒ基 因的染色体增加了， 第二个变化更为有趣 ， 即出现 了一条 只含 Ｄ Ｆ 基因 ＨＲ 的额外的小染色体。 这暗示 出， 在高等生物中 ， 特殊 在 情 况下 ，有可能创造 出含有令人感兴趣的遗传 物质的 新染色体。此点对于 高等植物系统可能很有价值。
生 的体细胞重组。已知，体细胞重组可 发生于果 蝇和 真菌 ，而且可以被某些物理和化学诱变剂所诱 发。现 在 看看在植物中体细胞重组如何造成基因拷贝数的变 积 。作箱物 中休细胞重组发 生 在 Ｄ 人 复制后的 Ｇ Ｎ ２
基 因 拷 贝 数 发生 的机 制 可 能 是 有 丝 分 裂过统对感兴趣的发
育组织或区域进行筛选 的例子。业 已证明，此法对坑 病原菌毒素和抗病毒 突变体 的选择也是有效的。 最后再讲讲负选择系统。在植物 中除 Ｐｌ ｃ 所 ｏｃ ａｏ 用的负选择系统外， 还有两种重要的负选择系统 ， ５ 即 － 滇脱氧尿苔 （ｒＵｄ Ｂｄ ｒ） 系统和 高氯酸盐系统。 Ｂｄ ｒ ｒ ｄ Ｕ 系统的基础是 ，合成 Ｄ Ａ 的细胞才能生长 ，不合 成 Ｎ Ｄ Ａ 的细胞不生长 ，生长的细胞可将有 毒的 Ｂｄ ｒ Ｎ ｒ ｄ Ｕ
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变体； 在植物系统中， 情况也如此。
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养基中加入某种对正常细胞有毒的化学物质，从而使
正常细胞不能生一而突 变体却可生长 的系统。它又可 长 以分 为两种 ：一 种是一步选择系统 ，即 只需通过一步 选择 ， 便可 筛选出突变体 ； 一种是 多步选择系统 ， 即通 过多步连续 选择才能筛选 出突变体。这 两种不 同的选 择系统可 以筛选出不同类型 的突变 体。现在 以植物悬 浮细胞培养 物的生长为例 ，着一 下这两种选择 系统 的 差别。 以悬 浮细胞生长数量对培 养时间作图 ，得 出其 生长 曲线。 细胞接种后经 过一 段滞缓期开始分 裂， 此 后细 胞数 量随 着培养时间 的延长 而增加 ，最后达到最 大值。平皿培 养细胞也如此。这种稳 定的生长型是在 不加有毒物 质时 （ 即有毒物 质的处理时间为零 ）得到 的。现在 看看加人有毒物 质（ 例如抗菌素 、 抗代谢物或 盐类 ） 后的情况。在 毒素剂量较低时 ， 滞缓期延长 ， 细 胞分 裂速 度放慢，细胞数量的最 大值降 低。毒素的剂 量不 同（ 例如 相对剂 量为 １ 单位 ， ０ １ 单位 、 ０ 单位或 １０ 更高）生长曲线也不同。根据这一 原理 ，便可选 出突 ， 变 细胞。 对于 一步选择系统来说 ， 加人的毒素剂 量应 当 较 高（ 例如 １０ ０ 单位） ，此 时未发 生突变的正常细胞不 能生 长，只有突变细胞才能生长。 对于 多步选 择系统 来说 ， 在低剂 量毒素的条件下， 养物的生长速度非常 培 缓慢 ，在 相 当长 的时间 内只有最 小量的细胞生长或存 活下 来，因此可以选 择生长 最快 的细胞群体。这是两 者在 选择速度上 的差 别， 此外还有 另一些重要 区别 ： 一 步 选择只需一次实验 ，即在 高剂量毒素的培养基 中寻 找突 变体， 而不管突 变是否 发生 ； 多步选 择则需经过几 个不 同步骤 ， 步加人低剂量毒素 ， ９％ 的细胞 第一 使 ０ 不能 生长 ， 中选 出生长较好的细胞 ， 从 然后再 依次增加 毒 素剂量 ， 行第二 轮、 进 第三轮等 筛选。 简言之 ， 一步选 择 只需一次实验 ， 多步选择则需要数次。 迄今所知道的 抗逆 性性 状一般都有几个不 同的水平，故需应 用多步
期和有 丝分裂初期。 假设两条同源染色体 上的杂合 等
位基因Ａ和ａ 位于着丝粒附近，并在着丝粒部位发生
重组。在 有丝 分裂过程 中，这两条染色体的染色 单体 可以独 立地分开 ，一 条染色体 的一个着丝点可 以移到 另一条染 色体 的一个着丝点部位 ，一条染色 单体也到 另一染色 单体 的一极 ，于是便造成含有纯合等位基因 （ Ａ ａ）的新染 色体。 由于 交换不 很准确 ， Ａ ， ｓ 单基因的 休 细胞重组有时便会在有丝分裂过程中增加或减少基 因的拷 贝数。此外 ， 用某些诱变 剂（ 还可 例如 丝裂霉素 Ｃ 低剂量的紫外线或 二 ， 射线 照射） 提高植物体细胞重 组 频率。 因此 ， 用低剂量 的物理和化学诱变剂， 结合上 述 的选择 系统 ， 就有可能更有效地增加基因剂量。 现在讲正选择系统存在 的问题和解决途径。主要 问 题是 ， 许多重要基因在 细胞培养物 中不表达， 故无法 筛 选相应 的突变体 ，例如杭杀草剂的突变体。许多杀 草 剂只能杀死进行光合作用的细胞、而培养细胞的光 合作用极微弱 ，所以无法在 细胞培 养物的水平上区别 突 变体和非突变休。要选择这类突 变体 ，就必须把着 眼点放在完整植株上 。叶片的细胞群很象培养皿中的 细 胞，其 中某些部位的细胞也能发生突变。我们可以 用实验 的方法对叶片造成正选择压力 ， 然后 切下组织 上 可以区辨的突变部位 ， 行培养， 进 使之再生成植株， 借此便可选 出抗杀草剂的突变体。我们以烟草 为例说 明 这一过程。取烟草 单倍体植株 （ 温室内生 长的小植 株 ）以 ５０ 拉德剂量的 ｒ ， ０。 射线进行处理 ， 片中有些 叶 细胞可 能发生 了抗杀草剂毒劳定（ｉｏ ｍ） 变 ， ｐ ｌａ 的突 ｃｒ 但 我 们无法 区别每个细胞 ， 故应让植物继续生长， 直至长 出十片新 叶。在此期间每个突变细 胞发生分 裂而形成 由突变细胞组成 的小区 ，这样我们 便可以对一群细胞 进行选择， 而不是对单个细胞。此时喷以杀草剂， 敏感 细胞逐渐变成 浅绿 、 和白色 ， 黄色 最后死亡 ； 而抗性小 区仍然呈绿色。取下活的绿色小区， 进行培养， 使之再 生成完 整植株。再生植株的染色体可 能已经加倍 ，估 计这种二 倍休才具有抗杀草剂的抗性。这些植株有些 是抗杀草剂的， 但并非全部， 故尚须进一步选择。杀草 剂抗性性状是 由一 个或两个基 因控制 的，可以按照孟
活性位点结合， 使其不能再作用于尿素的氨基， 从而使 取酶失活。Ｆｎ 的方法是，在细胞培养塞中同时加 ｉ。 ｌ
人作为氮 源的尿素和经基腺，这样 ，一部分脉酶分子 由于活性位点被经基脉 占 而失活 ，要达到与无经基 据 脉时同样 的生长水平 ，就需要有 更多的腺酶分子 ，因 此， 在尿素加羚基腺的培养基中生 长速度与只有尿素 的培养基 中相 同的细胞，便会含有更多 的脉酶。他用