721分光光度计的操作

仪器预热与调试
• 开机前，先确认仪器样品室内是否有东西挡在光路上。光路上 有东西将影响仪器自检甚至造成仪器故障。 1．打开电源开关，使仪器预热20分钟。 2．用“波长调节”旋钮将波长设定在要使用的分析波长位置上。 3．盖好样品室盖。用“方式设定”键（MODE）改变测试为透 光率（T）方式。 4．调“T=0”：用比色皿选择拉杆使比色皿槽处于“调零透射比” 位置，在T方式下，按“0％T”键，调透光率为零。 5．调“T=100”，推或拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于“参比 样品”位置，按“100%T”调100%透射比。
•条件：单色光，稀溶液 •Lambert’s Law（1760年）：It=Io×10-kb，A=kb b：液层厚度 -kc •Beer’s Law（1852年）： It=Io×10 ，A=kc
c:溶液浓度
光吸收基本定律
• Lambert-Beer定律(Lambert-Beer’s Law)
数学表达式： A= lg
透射光It
•Ia为吸收光强度
(Intensity of the absorbant light)
•Ir为反射光 反射光
(Intensity of the reflecting light)
•It为透射光强度
(Intensity of the transmitted light)
透光率(T)与吸光度(A)
物质的颜色
黄绿 黄 橙红 红紫 紫
吸收光颜色
紫 蓝 绿蓝 绿 黄绿
吸收光波长 范围(nm)
380~435 435~480 480~500 500~560 560~580
蓝
绿Fra Baidu bibliotek 蓝绿
黄
橙 红
580~595
595~650 650~760
液呈现透射光的 颜色。
– 被吸收的光与透 射过去的光称为 互补色光
吸光光度法(Spectrophotometry )的原理
• 标准曲线法的优缺点
定量分析方法-3
• 摩尔吸光系数法
– 摩尔吸光系数ε是溶液浓度为1mol/l，液层厚度 为1cm的吸光度。在已知ε的情况下(查文献)， 读取测定液厚度为1cm时的吸光度，即可根据 下式求得测定液的浓度。 – C=A/ε
• 摩尔吸光系数法的优缺点
• • • • •
吸光光度法的原理 吸光度的测量 定量分析方法 721E分光光度计的操作方法 721E分光光度计操作练习
分光光度计
仪器结构： 光源 钨丝灯 氢灯或氘灯 棱镜
可见光 (Visible Light) 紫外光 (UV Light)
单色器
光栅
玻璃 石英
可见光 紫外光
吸收池（比色杯、比色皿） 检测器 光电管 光电倍增管 检流计 数码管显示
显示器
测量条件的选择
• 入射光波长
– 一般选用被测物质溶液的λmax。可以获得较 高的灵敏度
5. 按 “MODE”将测试方式设置为A方式 6．拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于“样品”位，仪器自动显示 该样本的吸光度，记录数据。
Test2 Test2 Test1 Test2 Test1 Standard Test2 Test1 Standard Blank Test1 Test2 Standard Blank
定量分析方法-2
• 标准曲线法(standard curve method)
– 配制一系列不同的已知浓度 的测定物溶液，按测定管同 样处理显色，分别读取各管 吸光度 – 以浓度为横坐标，以吸光度 为纵坐标，绘制标准曲线。 – 测定未知溶液时，按测定管 的吸光度即可直接从标准曲 线上查得测定物的浓度。
样品测试
1．将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中
– – – – 拿放比色皿时应持其“毛面”不要接触“光面” 比色皿内的溶液面高度不应低于1.5cm 被测试的样品中不能有气泡和漂浮物 比色皿外的液体用滤纸吸干
2．打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别垂直插入比色皿槽中， 盖上样品室盖
– 比色皿的“光面”要与光源在一条线上, 垂直放置 – 参比样品通常放在样品架的第一个槽位中
定量分析方法-1
• 标准对照法(standard contrast method)
– 根据Lambert-Beer定律得： As=abcs (s=standard concentration) Ax=abcx (x=unknown concentration) cx=Ax/As×cs
•
标准对照法的优缺点
3．调“T=0”：拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于“调零透射比” 位置，在T方式下，按“0％T”键，调T=0 4. 调“T=100”：将参比溶液推入光路中，用“MODE”键改变测试 为“T”，按““100%T／0A”键调整T=100/ A=0
– 仪器在自动调整过程中，显示器显示“BLA”，数秒后显示100。
• 分光光度法：利用溶液对单色光的吸收度来
确定溶液中有色物质的含量
–有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关，浓度 愈大，颜色愈深
• 吸收曲线(absorbance curve)
– 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即可得到一
条吸光度随波长变化的曲线，称之为吸收曲线或吸收光 谱。 – 光吸收程度最大处的波长，称为最大吸收波长 (maximal absorbance wavelength) ，常用 λmax 表示。 – 在正常情况下，选用不同浓度的某种溶液，最大吸收 波长是固定不变的。
可用不加试样的“试剂空白”(reagent blank)作参比溶液；
c、若被测试液本身在测定波长处有吸收，而显色剂等 无吸收时，
可用不加显色剂等的“试样空白” (sample blank)作参比 溶液。
• • • • •
吸光光度法的原理 吸光度的测量 定量分析方法 721E分光光度计的操作方法 721E分光光度计操作练习
• 物体的颜色是哪里来的？
物质对光的选择性吸收
物质对光的选择性吸收
结论：
– 物质对光的吸收具有选择性，同一种物质对不 同波长的光的吸收能力不同，不同物质对同一 波长的光的吸收能力也不同 – 物质所呈现的颜色正是它对不同波长光选择性
吸收产生的在人视觉上的反映
• 溶液的颜色
– 当白光通过某一 溶液时，该溶液 会选择性地吸收 某些波长光而让 那些未被吸收的 光透射过去，溶
生物化学基本实验技能训练（二）
721E型分光光度计的原理 和使用方法
(Spectrophotometry )
三峡大学医学院生物化学教研室
实验目的(Purpose)
1、掌握721E分光光度计的原理、结构与操 作 方法
2、学习未知溶液的浓度测定方法 3、制作CuSO4标准曲线，并用以求得未知 CuSO4溶液的浓度
• 已知CuSO4溶液的浓度5%，测定末知 CuSO4溶液的浓度 • 方法 1、利用标准对照法测定 2、制作CuSO4标准曲线，测定未知CuSO4 溶液的浓度
操作（Method）
• 取5只试管，按右表操 作
• 混匀，在波长650nm， 用蒸馏水(参比溶液） 校正零点。读取各管吸 光度，记入右表。 方法一：以浓度为横轴， 吸光度为纵轴，绘制标 准曲线。 • 读取未知浓度CuSO4 溶液的光密度，从标准 曲线上查出其浓度。 方法二：以任意一管为标 准管，计算未知浓度 CuSO4溶液的浓度。
Io It
= -lgT=abc
吸光度 吸光系数 液层厚度 （absorbance） (absorptivity (path coefficient) length)
溶液浓度
(analyte concentration)
•吸光系数是物质的特征性常数
Lambert-Beer定律的偏离
(Limitations of the Lambert-Beer’s law )
•
控制适当的吸光度测量范围
– 最小误差出现在T%=20-65% (A=0.2 -0.7)的 范围内
•
选择适当的参比溶液
参比溶液的选择
a、当被测试液、显色剂及其他试剂在测定波长处都无 吸收时
可用纯溶剂(如蒸馏水 distilled water)作参比溶液；
b、当被测试液无吸收，而显色剂或其他试剂在测定波 长处有吸收时
• 透光率(Transmittance，T)
– T=It/I0×100％ – 透光率的变化范围：?
• 吸光度(absorbance，A)：
– 透光率的负对数，又称为光密度(Optical density，OD)
– A= -lgT= lg(I0/It)
– 吸光度的变化范围： ?
光吸收基本定律
• Lambert-Beer定律(Lambert-Beer’s Law)
主要内容(Contents)
• • • • • 吸光光度法的原理 吸光度的测量 定量分析方法 721E分光光度计的操作方法 721E分光光度计操作练习
吸光光度法(Spectrophotometry )的原理 • 问题：如何测定溶液中某一物质的浓度？ • 提示(酸碱滴定、氧化还原、络合滴定、沉淀等)
721E分光光度计 (Spectrophotometer )的结构
1．电源开关 2．“波长调节”旋 纽 3．方式设定键 （MODE） 4. “100%T／0A”键 5．“0％T”键 6．比色皿架（样品 室） 7．比色皿架拉杆
• 功能键介绍
1．电源开关 2．“波长调节”旋纽：设置波长。360-760nm. 3．方式设定键（MODE）：设置测试方式：T与A 4． “0％T”键：将比色皿架处于“调零透射比”位置。 T 状态下调T为零。波长不变时无需调“ 0％T”键 5．“100%T／0A”键：使比色皿处于“参比样品”位，用 于调整“T为100%”或“A为零”。当波长改变时，须重 新调整。 6．比色皿架：插放比色皿，有4个槽位。 7．拉杆：推或拉比色皿架拉杆，听到“咔嚓”声时，比色 皿已置光路中。第一声“咔嚓”，表示比色皿处于“参比 样品”位，第二声“咔嚓”， 表示比色皿处于“调零透 射比”
• 分光光度法：利用溶液对单色光的吸收度来 确定溶液中有色物质的含量
–有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关，浓度 愈大，颜色愈深
光的基本性质
• 光是一种电磁波，具有波动性和微粒性。 • 波长(λ)、频率(υ)和光速(c)之间的关系是 υ=c/λ • 电磁波谱图
图1－1 电磁波谱
• 人的眼睛能感知的光区称为可见光区(Visible Light) ，其波长范围约为380~760nm。
A
应用： • 可作为物质定性、定量 分析的依据
λ(nm)
图1-2 KMnO4溶液的吸收曲线
光吸收的基本概念

条件：一束平行单色光照射到均匀的、非散射的介质如溶液时
散射光 •I0=Ia+Ir+It •I0为入射光强度
(Intensity of the incident light)
入射光Io 吸收光Ia
• 偏离的原因
– 物质浓度太高，改变了被吸收光的折射 率。 – 仪器的局限性:入射光、杂散光、吸光 度读数（0.2-0.7） – 非对称的化学平衡
• 因其浓度、pH、溶剂和温度的改变，发生 解离、缔合、溶剂化和互变异构等化学变 化而发生偏离。
• • • • •
吸光光度法的原理 吸光度的测量 定量分析方法 721E分光光度计的操作方法 721E分光光度计操作练习
Photometric Mode: Transmittance, T 0% ~ 100% Absorbance, A 0~1 Concentration, C
Standard Test1 Blank
Standard Blank
（3）Determine
set T100% ： Blank
set T 0% ： A=1.----Standard、test1、2
试管号 1 5%CuSO4 溶液(ml) 1.00 蒸馏水 (ml) 4.00 浓度（%） 光密度
2
2.00
3.00
3
3.00
2.00
4
4.00
1.00
5
5.00
0.00
讨论（Discussion）
• 结合本人的实验结果，分析本实验中的 注意事项、误差产生的原因及减少措施。
• 思考题：
– p17：1、3题
T Blank handle 0
T A handle 1
handle2、3、4 assay A：
Rest state： handle 1 A=1.-----
• • • • •
吸光光度法的原理 吸光度的测量 定量分析方法 721E分光光度计的操作方法 721E分光光度计操作练习
721E分光光度计操作练习