细胞凋亡与疾病1

◎ 多途性
(1) 死亡受体途径
死亡受体是一组TNF受体基因超家族的成员，
包括Fas(CD95,Apo1)，TNFR1(P55,CD120a)，死亡
受体DR3 、DR4、DR5等。其结构特点为胞外区有一
半胱氨酸富集结构域(cystein-rich domain)，胞 内区有一死亡结构域(death domain, DD)。它们是 一组膜蛋白，与FADD结合，而FADD的聚集则通过其 死亡效应区(death effect domain,DED)激活
从而导致细胞凋亡
⊙ 细胞内caspases与其抑制剂总是共存，以免 Caspases酶原被意外激活，对正常细胞造成损伤
（3）caspases分类： 根据大小亚单位序列的同源性以及功能: 细胞因子处理组：1，4，5，11，12，13，
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凋亡起始组：2，8，9，10
凋亡效应组： 3，6，7，
(4)活化caspase的结构:前体的N-端前肽和
紫素 外、 线电 离、 辐糖 射皮 、质 激
TNFα
(4)DAG/PKC系统

(5)cAMP /PKA信号系统
PKA使关键的蛋白质
分子发生不同程度的磷酸
化，进而影响内源性核酸
内切酶的活性，在研究糖 皮质激素诱导胸腺细胞凋 亡时，即发现cAMP和内源 性核酸内切酶与细胞凋亡
呈正相关的现象。
(6)胞内Ca2+ 信号系统
4)V-FLIP：包含两个DED，与Caspase竞争结合死亡
受体复合物
5)蛋白HBx（乙肝病毒编码）： Caspase-3
②肽类抑制剂：

Ac-DEVD.CHO,AcYVAD.CHO,z-VAD.fmk
③Bcl-2蛋白家族：
④其他:NO及其相关分子，锌
4、大分子合成

(1)细胞凋亡需要RNA和（或）蛋白质的合成， 大分子合成抑制剂可阻断细胞凋亡；
细胞膜
凋亡相关 基因激活
细胞核
Caspases激活
凋亡过程
apoptosis 凋亡过程与调控
Caspases激活 Dnase激活 执行凋亡 凋亡细胞的清除
凋亡过程
(二 )细 胞 凋 亡 的 调 控 1.细胞凋亡的诱导与抑制
2.细胞凋亡信号的转导(transduction)
◎ 多样性 ◎ 偶联性 ◎ 同一性
现象。 *
* 晚期出现染色质边集(margination)。 * 线粒体和溶酶体的形态结构变化不大。 * 形成凋亡小体(apoptosis body),这是凋亡细胞
特征的形态学改变。
2、细胞凋亡与坏死的比较 坏 死 凋 亡
诱导因素 生化性质 特点 强烈刺激，随机发生 病理性，非特异性 被动过程，无新蛋白 合成,不耗能， 形态变化 细胞结构全面溶解、 破坏、细胞肿胀 DNA电泳 弥散性降解，电泳呈 均一DNA片状 炎症反应 溶酶体破裂，局部炎 症反应 凋亡小体 基因调控 无 无 较弱刺激，非随机发生 生理性或病理性，特异性 主动过程，有新蛋白合成， 耗能 胞膜及细胞器相对完整，细 胞皱缩，核固缩 DNA片段化(180-200bp)，电 泳呈“梯”状条带 溶酶体相对完整，局部无炎症 反应 有 有
细胞凋亡与疾病
（Apoptosis and disease）
何 芳 教 授
石河子大学医学院病理生理学教研室 二〇一二年九月
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概述
凋亡时细胞的主要变化
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细胞凋亡过程与调控 细胞凋亡的发生机制
细胞凋亡常用的研究方法 细胞凋亡与疾病
一.概述

(一)凋亡概念的提出 1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠 门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一 些散在的死亡细胞，显然不同于细胞坏死。 这些细胞体积收缩、染色质凝集从其周围 的组织中脱落并被吞噬，机体无炎症反应。 1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞 凋亡的概念。
三.细胞凋亡过程与调控
(一)细胞凋亡过程
凋亡信号转导 凋 亡 诱 + 导 因 素 受 体
cAMP
Ca2+ 神经酰胺
凋亡基因激活
死 亡 信 号 凋亡 相关 基因 激活
DNase激活 Caspases激活
细胞凋亡的执行
巨噬细胞 吞噬分解 凋亡细胞 凋亡细胞的清除
凋亡诱导因素 +
受体 cAMP Ca2+ 神经酰胺 死亡信号 信 号 转 导 Dnase激活
1. 凋亡早期即发生；
2. 核小体间连接部位断裂成180～200bp整倍数片段；
3. 染色质DNA单链断裂。
2.内源性核酸内切酶激活及其作用
(Ca2+/Mg2+) DNaseⅠ、DNase Ⅱ (pH=6.2左右）
,TopoⅠ 、 Topo Ⅱ（解旋）
3. caspases 激活
（1）caspases 的结构
无梯状DNA
几分钟到几小时 放线菌素D及放线 有时阻断死亡 溶酶体增加，c-myc, c-fos?
梯状DNA图谱
核DNA电泳
首先的表现
蛋白质合成下降，方式改变
内源性核酸酶活化
4、细胞凋亡与胀亡的比较 胀亡 凋 亡
早期 细胞肿胀波及胞内结构 胞浆疏松化并且有空泡形 成体积增大 形态变化 胞膜完整性破坏、 细胞器崩解 DNA电泳 非特异性 DNA片段 炎症反应 周围明显炎 DNA片段化(180-200bp)，电 泳呈“梯”状条带 溶酶体相对完整，局部无炎症 胞膜及细胞器相对完整 细胞皱缩、体积缩小、胞浆浓缩 及出芽改变
相关蛋白很高的同源性，编码三个蛋白：Bax-α、
Bax-β和Bax-γ。bcl-2与Bax的比率不同也可影响细 胞凋亡。
2.细胞凋亡的分子生物学研究阶段: 1）细胞凋亡的相关基因及调控 2）细胞凋亡的信号转导 3）细胞凋亡的各种分子及其相互作用 3.细胞凋亡的临床应用基础研究阶段
(三)细胞凋亡生物学意义
•确保正常发育、生长。
•维持内环境稳定。 •发挥积极的防御功能。
二.凋亡时细胞的主要变化 (一)形态学改变
正常

apoptosis (细胞凋亡)：由体内
外因素触发细胞内预存的死亡程序而
导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡， 又称programmed cell death,PCD
(程序性细胞死亡)
(二)细胞凋亡的研究历史
1.1972-1987：细胞凋亡的形态学及生物化 学研究阶段： 1）利用光镜和电镜对形态学特征进行了详细 的研究。 2）染色体DNA的降解。 3）RNA/蛋白质大分子的合成。 4）钙离子变化。 5）内源性核酸内切酶。
3、 细胞凋亡、PCD的区别 特征
形态学 膜完整性
PCD
细胞固缩，裂成小体 保持到晚期
细胞凋亡
同左 同左
线粒体
染色质 自噬作用
常有阵发的自噬作用
凝聚，电子致密度加大 常有，但并非一定发生
无变化
着边 无
潜伏期 蛋白质合成 胞浆生化变化
几小时 放线菌素D及放线菌酮 阻断死亡 溶酶体酶活性有时增加， 偶有热休克蛋白、c-myc， c-fos↑
的连续合成所抑制，此时蛋白质或RNA合
成抑制剂能促进细胞凋亡的发生。

5、钙离子的动员
Ca2+↑引起细胞凋亡的机制
损伤刺激 线粒体 肌浆Ca2+↑
肌浆网
钙蛋白酶
磷脂酶
谷氨酰胺 转移酶 骨架蛋 白破坏
核酶 染色体 损伤
染色质 磷脂分解 凝集
似秋叶的凋零，
告别生命之辉煌；
那难以计数的攻击、诱导，
轻启着道道程序，
大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽，然 后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，由大亚 基和小亚基组成异源二聚体，再由两个二聚体形 成有活性的四聚体。
（5）caspases激活方式：
⊙自活化（autoactivation）:长原结构域
⊙转活化（transactivation）:短原结构域
⊙连接调节亚单位激活:
等,存在于线粒体膜上。 抗凋亡的主要机制是：
◎直接的抗氧化 ◎抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质 ◎抑制促凋亡调节蛋白Bax、Bak的细胞毒 作用 ◎抑制凋亡蛋白酶(caspases)的激活 ◎维持细胞钙稳定
2)促进凋亡bax亚族：bax、bak、bad、bik、bid
等，存在于线粒体膜上和内质网膜上。Bax与bcl-2
3.凋亡相关基因
(1)bcl-2及其相关基因： B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2）， 1984年从滤泡性淋巴 瘤发现，存在于核膜和线粒体。1988年首次证实
bcl-2基因的高表达可引发肿瘤，bcl-2家族至少
有15个成员。
1)抑制凋亡bcl-2亚族：bcl-2、Mcl-1、bcl-w
⊙非caspase蛋白酶的活化 （activation by
non-caspase proteinases）:细胞毒性T淋巴细
胞的颗粒酶B(caspase -3,7,8,910 ） ，组织蛋白酶
G (caspase -7 ）
Apaf-1
（6）目前已知的Caspase功能有：
① 灭活凋亡抑制蛋白。 ② 直接作用于细胞结构，裂解核纤层，使核纤 层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。 ③ 分解与细胞骨架构成相关的蛋白其中包括凝
逼细胞步步走向生命的末端；
啊，活性氧处处肆虐， 钙波涛惊石裂岸， 线粒体把生命之光一点一点拧淡;
危难中的细胞啊，
你沉稳不乱，
DNA片片切割，
化云梯直通天堂；
细胞体分团相聚， 把生命的凝重浓集在小体上； 分别了朝夕相处的伙伴， 再见了快乐美好的时光；
这一切的一切又融入临近的胞体，
腾出的空间再写生命的篇章。
症反应
凋亡小体 无
反应
有பைடு நூலகம்
1997年美国毒理病理学会细胞死亡命名委员会将细胞死亡 途径分为凋亡和胀亡（Oncosis）
(二)细胞凋亡的生化改变
1.DNA的片段化：判断凋亡发生的客观
指标之一
内源性核酸内切酶作用引起的DNA断裂产生 的单链缺口优先发生于核小体连接区，使DNA断 裂成核小体倍数大小的片段, 即180-200bp倍数 大小的片段, 在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的阶 梯状DNA区带。
结构:caspase成员都具有相似的氨基酸序
列、结构和底物特异性，正常时它们都以酶原
（30-50KD）形式存在，包括三个结构域：一个N
末端原结构域，一个大亚基（20Kd），一个小亚
基（10kd）。
（2）caspases特点：
⊙活性中心半胱氨酸
⊙在催化底物时，总是在天冬氨酸残基的C端裂解
底物 ⊙ caspases酶原的活性很低，需要切除氨基端的 一段序列才能被激活 ⊙活化的caspases能够特异水解一套蛋白底物,
caspase-8。
Fas配体(凋亡信号) Fas(DR)
细胞膜
Fas(death domain)
FADD(Fas-associated
death domain)
Caspase-8
(2)线立体途径:
(3)以神经酰胺为第二信使介导的细胞 凋亡
神经酰胺 (ceramide) SMase 鞘磷脂 磷酸胆碱 (phosphoc holine)

(2)细胞凋亡发生前所需生物大分子已存在于细
胞内，只是被分割开来或以无活性状态存在，
其活化需要磷酸化、去磷酸化或某些离子的存
在,除非有活化信号传入，它们对细胞并不造成 损害，这种情况下细胞凋亡不受蛋白质或RNA合 成抑制剂的影响；

(3)细胞内已有凋亡所需的大分子物质，
只是其功能被其它生物大分子（如bcl-2）
胶原蛋白（gelsin）、聚合粘附激酶（focal
adhesion kinase ,FAK）、P21活化激酶α（PAKα ）等，引起细胞结构重组、凋亡。 ④caspase可使一些与DNA修复、复制和mRNA缝结 有关的蛋白的调节区和催化区解离，瓦解核结构，
使细胞降解为凋亡小体。
(7)Caspase的抑制剂： ①病毒性抑制剂：

1)牛痘病毒蛋白CrmA（cytokine response modifier A）：直接作用于成熟Caspase活 性位点
有效抑制Caspase1，4，6，8，对Caspase2， 3，7，10效果差

2)P35:以竞争性结合的方式与靶分子形成稳 定的具有空间位阻效应的复合体
3)杆状病毒蛋白IAP（inhibitor of apoptosis family protein，7种），不是活性位点特异性抑 制剂
细胞 凋亡小体
吞噬细胞 坏死 凋亡
细胞凋亡与细胞坏死的比较
1、凋亡的主要形态学变化
1) 细胞间连接丧失； 2）胞体固缩； 3）细胞器完整； 4）核固缩； 5）染色质边集；
6）凋亡小体形成
表面的微绒毛消失，并逐步脱离与周围细胞的接 触。
* 细胞体积逐渐缩小，出现固缩(condensation)。 * 胞浆脱水，胞膜迅速发生空泡化(blebbing)。 * 内质网扩张并与胞膜融合，形成出芽(buding)