层析技术在蛋白质纯化中的应用

层析技术在蛋白质纯化中的应用

概述

一．层析技术的基本原理

各种层析法虽然实验机理和实验方法大相径庭，但基本原理却都一样。即在所有的层析法中，均存在固定相和流动相。

为了更方便阐明层析技术的基本原理，引入“有效分配系数”这一概念，这一概念指的是在一定的温度、压力和一定溶剂系统中，一种物质分配达到平衡时，物质在固定相中的总量与在流动相中的总量的比值。

层析技术的分离原理可用下图表示：

图一层析技术的分离原理

将1ml含有32ug的蛋白的样品加到柱子上面，占据了柱子的A位置，假定该蛋白的“有效分配系数”为1，则平衡后，该蛋白在固定相和流动相中的量均为16ug；有1ml流动相加到柱上，平衡后，有16ug的样品被带到B位置；再有1ml流动相加到柱上，B位置上的蛋白将有8ug到达C位置，而A位置上的蛋白也将有8ug带到B位置，就呈现出A位置8ug，B位置16ug，C位置8ug。依此类推，假定经过5次平衡后蛋白被分配到整个柱中，此时柱中的蛋白分配量为A位置2ug，B位置8 ug，C位置12 ug，D位置8 ug，E位置2 ug。这样在柱子中部就形成了一个浓度峰。如果该蛋白的有效分配系数大于1，则浓度峰在柱子中部以上；有效分配系数小于1，浓度峰在柱子中部以下。

当然，只经过5次平衡形成的浓度峰是比较平坦的，但不难想象，若经过成百上千次的平衡，那么浓度峰就将越来越尖锐，蛋白在柱子某一位置被富集起来，浓度越来越高，这就是层析技术的基本原理。

事实上，流动相是连续不断地加入到柱子上的，因此柱上的平衡是连续发生的，在一个正常工作的柱子上发生着上千次的平衡，所发生的平衡次数我们称为“理论塔板数”，“理论塔板数”越多，柱子的分离效果就越好。

为了提高层析的理论塔板系数，通常使用细长的层析柱；并尽可能的使用细颗粒的固定相，但过细的颗粒会影响流速；流动相经过固定相时的速度要慢一些，以使蛋白在两相中能够达到分配平衡。上样体积也应受到控制，上样体积越小，展开后形成的峰越集中，这也能提高分离效果。

图二不同塔板数的分离效果

总结：由于样品中各组分在特定的固定相和流动相中分配系数的不同，致使它们通过柱子的速度有差异，分配系数小的组分先离开柱子，从而与分配系数大的组分分离；在层析柱上各组分的峰形则取决于理论塔数，增加理论塔数，组分间的分离效果就更为优越。二．层析法的分类

1．按照层析过程的机理可分为以下几类：

亲合层析：利用特定蛋白对某种配体的生物专一性的亲合进行分离；

吸附层析：利用吸附剂对不同组分吸附性能差异进行分离；

离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂的亲合力的强弱进行分离；

凝胶过滤：利用凝胶对不同大小的分子所表现的通透性能的差异进行分离；

分配层析：利用不同组分在流动相和固定相中溶解度的差异进行分离；

高效液相层析：利用特有的固定相担体，高压输液与自动分析仪结合而进行分离。

……

2．根据层析方式不同可分为柱层析与薄层层析等。

亲合层析技术

一．原理

亲合层析是利用蛋白质与其配体之间所具有的专一性亲合力而设计的层析方法。例如，酶和酶的抑制剂、抗原和抗体，酶蛋白与辅酶之间都有相应的亲合力，在一定的条件下它们能够形成紧密结合的复合物。如果在不溶性的载体上固定复合物中的某一组分，就可以从溶液中专一的分离和提纯另一个组分。采用亲合层技术的优点是可以得到基本纯的产品，且分

离速度快，因此在蛋白质的分离和提纯中占有特殊的地位。

亲合层析过程如下：

图三亲合层析基本过程示意图

将亲合层析的欲分离物的配基在不降低生物活性的条件下与不溶的载体结合固定后装入色谱柱。在有利于配基与欲分离蛋白之间形成络合物的条件下将样品加入亲合层析柱中。这时，样品中只有欲分离物与配基形成络合物而被吸附，不能形成络合物的杂质则直接流出柱子。充分洗涤，将所有不能专一吸附的杂质除去后，使用能破坏欲分离蛋白-配基络合的洗脱液，促使欲分离蛋白与配基分离，将目的蛋白洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。

从以上所述中我们可以得知，亲合层析的优点在于能在温和的条件下高效率的分离。

二．亲合层析的载体选择

亲合层析载体是负载配基的支持物，直接影响目的蛋白与配基之间的相互作用，理想的载体应具有以下条件：

1．均一，有一定的硬度，不溶于水；

2．多孔网状结构，易被大分子物质渗透；

3．具有相当数量可供偶联反应的基团；

4．没有吸附能力，不会发生非专一性吸附；

5．有足够的化学稳定性，能经得住吸附、吸脱和再生时所用的各种试剂的处理；

6．不受微生物腐蚀和酶解；

7．亲水。

目前，没有一种载体能够满足以上的所有条件，较常用的载体有琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等，最常用的是琼脂糖凝胶。

三．亲合层析配体的选择

配体是亲合层析中最重要的部分。选择好的配体应遵守以下三个标准：

1.能和欲分离的目的蛋白发生专一性吸附，亲合力越大越好；

2.吸附后在适当的条件下能够分离，且分离所使用的条件对蛋白的活性不受影响；

3.配体上必须有适当的基团能够用化学方法将其偶联到载体上，而且这种偶联不损害

配体与蛋白的专一性结合。

一般来讲，用于亲合层析的配体主要有三大类：

1．对特定蛋白有亲合力的小分子配体，如酶底物（或底物的类似物）、调节配体、酶辅助因子等；

2．对特定蛋白有亲合力的大分子物质，如抗体、蛋白类抑制剂等；

3．共价亲合层析中的配体，它含有能与目的蛋白共价可逆作用的部分。

小分子配体与目的吸附专一性较差，常常在缓冲液中加入共配体和寻找最佳的实验条件来增强目的和配体的亲合力。

四．亲合吸附剂的制备

亲合吸附剂的制备首先要使载体活化，然后与配体进行偶联。依据载体的性质不同，载体的活化与偶联的方法也有很大的差异。这里阐述最常用的载体—多糖类载体的活化及偶联方法。

多糖类载体的活化常用溴化氰法。溴化氰与多糖在碱性条件下反应，当有连位羟基存在就形成活泼的亚氨碳酸盐。亚氨碳酸盐对化合物的亲核反应十分敏感，生成N-取代异脲、