免疫细胞分离技术(终)

分离过程
• （1）分层液置试管底层 • （2）肝素抗凝全血以Hanks 液或PBS 液作适 当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两 者形成一个清晰的界面 • （3）水平式离心 • （4）不同层次的液体和细胞带 • （5）吸取单个核细胞层
Ficoll 分层液法
• 分离成品：淋巴细胞 单核细胞 • 分离纯度：95%左右，其中淋巴细胞约占 90%~95%
得纯度较高的白细胞悬液
聚合物加速沉降法
• 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右 旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（PVP）等使红细 胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白 细胞分离。
• 优点：本法的细胞获得率比自然沉降法高。
吞噬细胞的分离和收集
• 方法：斑蝥敷贴法 • 操作：用滤纸蘸取10％中药斑蝥酒精浸出液，贴 敷在臂内侧皮肤表面，4～5h后皮肤局部充血， 48h后局部形成水疱，吸取疱中的组织液，内含巨 噬细胞； • 优点：可从人体组织液中获取较纯的巨噬细胞， 不需作进一步体外分离，细胞量损失较少；
纯淋巴细胞群的采集
• 实验原理：利用单核细胞在37℃和Ca2+存 在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼 龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性；
• 实验方法：粘附贴壁法 吸附柱过滤法 磁铁吸引法
2013-5-23
Hale Waihona Puke Baidu
粘附贴壁法
• 将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑 料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置 1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁 上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴 细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单 核细胞群。 • 缺点：因B细胞也有贴壁现象，用本法分离 的淋巴细胞群中B细胞有所损失。
分离过程
• （1）用Percoll原液(密度1．135)与约等量的磷 酸缓冲液均匀混合 • （2）高速离心后，形成一个从管底到液面密 度逐渐递减的连续密度梯度 • （3）将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在 液面上 • （4）低速离心后，得四个细胞层。表层为死 细胞残片和 血小板，底层为粒细胞和红细胞， 中间有两层，上层富含单核细胞(78％)，下层 富含淋巴细胞(98％）。
2013-5-23
亲和板结合分离法（阳性选择法）
• （1）将相应抗体结合于塑料平板上 • （2）加细胞悬液 • （3）各种淋巴细胞亚群具有不同抗原性的特点和 表面标志，抗原阳性的细胞与相应的固相抗体结合， 吸附在平板上 • （3）多次细胞洗涤后我们将得到吸附在平板上的 抗原阳性细胞 • （4）同理若用特异性抗原交联于塑料板上，则可 分离得到具有特异抗原受体的淋巴细胞。但淋巴细 胞受体与特异抗原或抗体连接后有可能引起细胞激 活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时， 即将其用于阴性选择，本法更合适。
• 阴性选择法：选择性去除不要的细胞，仅 留下所需的细胞的方法；
2013-5-23
淋巴细胞亚群的分离
• 通过以上两步的实验分离操作，我们得到 纯度比较高的淋巴细胞混合液。然而在具 体的实验操作中，我们还需要将淋巴细胞 进一步的进行分离。 • 原则：根据相应细胞的特性和不同的标志 加以选择性纯化； • 阳性选择法：凡根据细胞的特性和标志选 择纯化所需细胞的方法； • 阴性选择法：选择性去除不要的细胞，仅 留下所需的细胞的方法；
免疫细胞分离技术 （针对淋巴细胞）
41110111 向珍娟 41110124 龚琦青 41110131 周武
免疫细胞分离技术的意义
• 我们知道进行有关细胞免疫方面的检测，特别 是有关免疫细胞功能的体外实验，往往须将待 检淋巴细胞从血液或组织中分离出来，而外周 血会有多种细胞成分，包括淋巴细胞、单核细 胞、粒细胞、红细胞和血咆群体。但有些细胞 如淋巴细胞的物理特性及生化特性与其他细胞 差异甚微，用简单的方法不容易分纯，因此产 生了专门的细胞分离纯化技术。
• 白细胞分离
• 吞噬细胞的分离和收集 • 淋巴细胞分离
白细胞的分离
• 自然沉降法
• 聚合物加速沉降法
自然沉降法
采集血液
抗凝（如加肝素）
试管直立静置室温 （30~60min）
离心 弃上清并洗涤
加 蒸 馏 水 反复洗涤 低渗处理（裂 解红细胞） 置新试管中
吸管吸取 白细胞层
血浆层 白细胞层 红细胞层
• 缺点：此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起 局部感染，应慎用。
2013-5-23
淋巴细胞分离三步走
• （一）外周血单个核细胞的分离
• （二）纯淋巴细胞群的采集 • （三）淋巴细胞亚群的分离
（一）外周血单个核细胞的分离
• 外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核 细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不 同，红细胞和多核白细胞密度较大，为 Ficoll 分层液法 1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为 1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为 此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近 于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心， 使一定密度的细胞按相应密度梯度分布， 从而将各种血细胞加以分离。
• 操作：在单个核细胞悬液中加直径为3μm的 羰基铁颗粒，置37℃温箱内短时旋转摇动， 待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁 铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋 巴细胞。
2013-5-23
（三）淋巴细胞亚群的分离
• 原则：根据相应细胞的特性和不同的标志 加以选择性纯化； • 阳性选择法：凡根据细胞的特性和标志选 择纯化所需细胞的方法；
荧光激活细胞分离仪(FACS)分离法
• 主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞 排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷 嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的 均匀小滴（40000个/s），每小滴内最多含一个细胞（其 中只有百分之几的液滴中含细胞），细胞经激光束照射产 生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号， 数据经电脑处理，分辨细胞的类型。如识别的是预计所需 的细胞时（如T细胞、B细胞要其亚群），在细胞样品流断 裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷， 使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管; • 优点：用FACS分离细胞准确快速，能保持细胞活力，并可 在无菌条件下进行； • 局限：仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手 段
Percoll 分层液法
• Percoll分离液法是一种连续密度梯度离心分 离法。 • Percoll 是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理 的硅胶颗粒，对细胞无毒性。Percoll 液经高 速离心后可形成一个连续的密度梯度，不 同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区 带，从而将密度不等的细胞分离纯化。
2013-5-23
免疫磁珠法分离细胞原理：
• 免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与 连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中， 通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场 中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁 珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停 留，从而使细胞得以分离。 • 免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法： 阳性分离法－磁珠结合的细胞就是所要分离获 得的细胞 阴性分离法－磁珠结合不需要的细胞，游离于 磁场的细胞为所需细胞。
2013-5-23
荧光激活细胞分离仪
2013-5-23
整体分离结果
• 至此，通过细胞分离技术，淋巴细胞分离 三步走已完成
尼龙毛分离法
• 原理：本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼 龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。 • 操作方法：取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺 纤维），均匀充填在内径5～6nm的聚乙烯塑料管 （饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将单个 核细胞悬液加入柱内，放37℃温箱静置1～2h。用 预温的含10％～20％小牛血清培养液灌洗，洗脱 液内含有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管 内残留的T细胞。再用冷或温培养液边冲边洗边挤 压塑料管，此时洗脱液内富含B细胞。 • 优点：如此得到的T细胞纯度在90％以上，B细胞 纯度可达80％。
外周血单个核细胞的分离
Ficoll 分层液法
Percoll 分层液法
分层液
• 基本要求
①对细胞无毒 ②基本等渗 ③不同于血浆等分离物质 ④有一定的比重
• 最佳选择（目前）
Ficoll（聚蔗糖-泛影葡胺溶液）： 2份6％聚蔗糖 蒸馏水溶液+1份34%泛影葡胺生理盐水溶液组成， 其比重为1.077±0.002.
2013-5-23
吸附柱过滤法
• 将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡 聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附 能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层 中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细 胞；
• 优点：此法简单易行，对细胞极少损害。
2013-5-23
磁铁吸引发法
• 原理：利用单核细胞具有吞噬的特性；
分离方法
1. 2. 3. 4. 5.
E花环沉降法 尼龙毛分离法 免疫吸附分离法 免疫磁性微珠分离法 流式细胞仪分离法
E花环沉降法
• 基本原理：T 细胞有羊红细胞受体(E受体)， 可以与羊红细胞结合形成较大的E 花环的特 性，可将T 细胞和B 细胞分离。
分离过程
• • • • （1）将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合 （2）淋巴细胞形成E 花环 （3）用淋巴细胞分层液分离 （4）浮悬在分层界面的细胞群则富含B 细胞，而 T 细胞由于与羊红细胞结合形成E 花环后比重较大， 则沉降在管底 • 相关拓展：用神经氨酸酶预处理羊红细胞将有利 于花环的形成和增加稳定性。另外将沉降在管底 与羊红细胞结合的T 细胞经低渗法处理可使围绕 细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，又可得到E 受 体阳性的T细胞群。
2013-5-23
免疫吸附分离法---亲和板结合分离法
• 原理：各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将 相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡 抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的 细胞可从未吸附的细胞悬液中获取；
2013-5-23
亲和板结合分离法
• 同样若用特异性抗原交联在塑料板上，则 可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞。 淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可 引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液 内某一细胞亚群时，本法更适用。 • 如要分离CD4+或CD8+细胞，则可用抗CD4 或CD8单克隆抗体吸附。用抗Ig抗体则可分 离B细胞。同样，用活化的C3包被，可分离 出有C3受体的细胞。
Percoll分层液法
连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图
• 优点：纯化单核细胞和淋巴细胞； • 缺点：操作流程较长，手续较多。
（二）纯淋巴细胞的分离
• 根据密度离心分离法获得的淋巴细胞主要 混合在单个核细胞悬液中，由于淋巴细胞 在数量上占单个核细胞的大多数，因此， 单个核细胞有时也可以大致地代表淋巴细 胞直接用于某些实验，但严格地讲，采用 上述方法获得的单个核细胞需去除单核细 胞才能较为准确地代表淋巴细胞用于实验。