白芨的无菌萌发与组织培养
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3讨论
3. 1 白芨种子的无菌萌发 本实验白芨的种子在 各培养基上的萌发率均达 90% 以上,除极少数种 子可能因培养基失水而未能吸涨外,均能萌发. 张 建霞等[6]发 现 蒴 果 的 胚 龄 越 长,白 芨 种 子 的 有 胚 率越高. 本研究所用的白芨蒴果为野外采集的已经 成熟但尚未开裂的蒴果,显然是正常有性生殖的类 型,故萌发率高.
摘要: 以白芨成熟蒴果为材料,在不同培养基上进行无菌播种,种子萌发后利用组织培养方法进行无性系 繁殖. 试验结果表明: 种子萌发的最佳培养基为 1 /2 MS + 6 - BA 1. 0 mg / L + 1% 活性炭; 丛生芽增殖的最佳培 养基为 MS + 6 - BA 1. 0 mg / L + NAA 0. 15 mg / L; 不同于已有的研究结果,1 /2MS + 0. 5 mg / L NAA 用于生根的 效果不佳,有待进一步研究.
云 南 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) ,2010,32 ( S1) : 422 ~ 425 Journal of Yunnan University
CN 53 - 1045 / N ISSN 0258 - 7971
*?
白芨的无菌萌发与组织培养
叶 静,郑晓君,管常东,牛 芸,马海英
( 云南大学 生命科学学院,云南 昆明 650091)
第 S1 期
叶 静等: 白芨的无菌萌发与组织培养
425
参考文献:
[1] 《全国中草药汇编》编写组. 中草药汇编( 上册) [M]. 北京: 人民卫生出版社,1976.
[2] 周至明,黄程生,彭丽丽,等. 白及人工种植初步研究 [J]. 中药材,2006,29( 1) : 7-8.
h /d.
中,常存在不同发育时期的原球茎、芽和幼苗.
生根培养基为 1 /2 MS + NAA 0. 5 mg / L + pH 2. 2 丛生芽诱导 1 cm 高的单苗转接到不同的
5. 8 和 1 /2 MS + NAA 0. 5 mg / L + 1% 活性炭 + pH 丛生芽诱导培养基中,15 d 后便可观察到原球茎出
424
云南大学学报( 自然科学版)
第 32 卷
图 1 种子无菌萌发( A) ,丛生芽诱导( B) ,生根诱导( C) Fig. 1 The germination of Bletilla striata seed( A) ,Multiple shoot buds induction( B) ,Rooting of tube plantlets( C)
* 收稿日期: 2010 - 06 - 25 作者简介: : 叶静( 1990 - ) ,女,吉林人,云南大学 2007 级生命科学与技术基地班本科生. 通讯作者: 马海英 ( 1971 - ) ,女,博士,主要从事结构植物学与植物发育生物学方面的研究,E - mail: mahy@ ynu. edu. cn.
1 材料与方法
1. 1 植物材料 实验采用的是成熟未开裂的野生 白芨蒴果,采自云南省昆明市嵩明县果东村后山. 1. 2 实验方法
( 1) 无菌播种 将采集的成熟未裂开的蒴果
先用 75% 的酒精表面消毒 30 s,再用 0. 1% 的升汞 ( HgCl2 ) 消毒 10 min,无菌水冲洗 5 ~ 6 次,用无菌 滤纸吸干表面水分. 然后在无菌条件下,用消过毒 的手术刀切开蒴果顶部,用无菌镊子将种子均匀抖 落在培养基上,立即盖上瓶盖,做好标记后,放在培 养箱进行 暗 培 养 5 d,再 移 至 培 养 室,培 养 温 度 ( 25 ± 2) ℃ ,光照度 2 000 ~ 2 500 lx,光照 12 h / d.
第 S1 期
wk.baidu.com
叶 静等: 白芨的无菌萌发与组织培养
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( 2) 丛生芽增殖 无菌条件下,将约 1 cm 高的单苗 转接到不同的丛生芽诱导培养基中,每种培养基配
2结果
制 5 瓶. 培 养 温 度 ( 25 ± 2 ) ℃ ,光 照 度 2 000 ~ 2. 1 种子无菌萌发 种子播种于培养基上进行培
其中 6 - BA 设置了 0. 5,1. 0,1. 5,2. 0 mg / L 等 4 个
从种子萌发数量来看,4 号与 7 号培养基的种
梯度,而 NAA 的质量浓度均为 0. 15 mg / L,因此培 子萌发率明显高于其它培养基,并且长势较好、萌
养基为 MS + 6 - BA 0. 5 ~ 2. 0 mg / L + NAA 0. 15 发较快,即以单一激素 6 - BA 且其质量浓度为 1. 0
mg / L + pH 5. 8.
mg / L 时萌发效果最好. 其中 7 号培养基的种子萌
( 3) 生根诱导 将诱导出的丛生芽切成单苗 发又明显早于 4 号培养基. 有些原球茎在培养 60d
分别转接到丛生芽诱导培养基和生根培养基上. 培 之后,长出了幼叶,同时很少数的原球茎则会继续
养温度( 25 ± 2) ℃ ,光照度 2 000 ~ 2 500 lx,光照 16 长大但并 不 分 化 出 幼 叶 ( 图 1A) . 在 同 一 培 养 基
6 - BA / ( mg·L - 1 ) NAA / ( mg·L - 1 )
总接种数 /个
总萌芽数 /个
诱导率 /%
0. 5
0. 15
50
16
32
1. 0
0. 15
50
44
88
1. 5
0. 15
50
42
80
2. 0
0. 15
50
32
64
从表 2 可见,6 - BA 质量浓度为 1. 0 mg / L,NAA 为 0. 15 mg / L 时诱导率最高,丛生芽长势较好,诱导 率最高,相 较 于 其 它 不 同 浓 度 的 培 养 基 中 的 苗 健 壮,颜色鲜绿. 6 - BA 浓度较低时,丛生芽诱导系数 降低,苗细小,颜色偏黄. 6 - BA 浓度较高时,也会 使丛生芽诱导率降低,但又比 6 - BA 浓度较低时 的诱导率高. 2. 3 根诱导 在无菌操作条件下,将诱导出的丛 生芽切成约 2 cm 高的单苗分别转接到的两种根诱 导培养基中.
通过实验表明,白芨种子在单一激素 6 - BA 且其质量浓度为 1. 0 mg / L 的培养基中萌发效果最 好,这与袁宁等[7]的结果相似. 此外,本实验对培 养基中添加活性炭的研究表明,活性炭可以有效地 促进白芨种子在基本培养基上的萌发,其萌发率和 萌发速率都明显地高于其他培养基. 3. 2 不同生长调节剂对白芨丛生芽增殖与生根诱 导的影响 根据前人的研究,本实验主要使用了 6 - BA 和 NAA 2 种植物激素. 结果表明,不同浓度 的 6 - BA 对 白 芨 丛 生 芽 的 诱 导 有 很 大 影 响,而 NAA 的影响很小. 当 6 - BA 质量浓度为 1. 0 mg / L 时诱导率最高,这与朱玉球[8]、吴华芬[9]等的结果
白芨的种子非常细小且无胚乳,因此在自然状 况下很难萌发和生长,实生苗的栽培较为困难,传 统栽培主要靠分株繁殖[2 - 5]. 但分株繁殖周期长, 繁殖效率低,而且耗种量大,很难满足大量栽培的 需要. 组织培养技术可以快速繁殖大量种苗,远较 分株繁殖法快捷高效. 本文采用白芨成熟蒴果为材 料,在不同培养基上进行无菌播种,种子萌发后利 用组织培养方法进行无性系繁殖,旨在实现白芨种 苗的规模化生产而探索有效的快速扩繁技术.
5. 8.
现很多个小突起,30 d 左右即可观察到丛生芽长出
以上培养基均含 w ( 蔗糖) = 3% ,w ( 琼脂) ( 图 1B) .
= 0. 9% .
表 2 6 - BA 不同浓度对丛生芽诱导的影响
Tab. 2 Effect of different concentrations of 6 - BA on multiple shoot buds induction
相似. 诱 导 生 根 阶 段,绝 大 多 数 采 用 的 都 是 添 加 NAA,过去对白芨的多项研究也是采用 NAA 诱导 生根[8 - 10]. 本研究也采用 1 /2 MS + NAA 0. 5 mg / L 的培养基进行生根诱导. 但与过去报道的研究结果 不同,本实验采用此培养基的生根效果不够理想. 这可能和兰科植物本身的根发育特性有关,也可能 和实验期间温度降低有关. 为保证移栽的效果,今 后还需要对此进行深入研究. 3. 3 活性炭对白芨组织培养的影响 在植物组织 培养中经常要用到活性炭. 活性炭的加入可以促进 或抑制离体生长. 通过实验发现,加入活性炭有利 于种子的萌发以及白芨幼苗的生长. 而在诱导白芨 苗生根时,活性炭的加入会抑制生根,其原因可能 是因为活性炭会吸附培养基中由白芨生长代谢产 生的有毒物质,从而有利于种子的萌发,以及白芨 幼苗的生 长,但 同 时 活 性 炭 也 会 吸 附 部 分 营 养 物 质,本实验生根培养时使用 1 /2 MS 的培养基,其营 养物质浓度低. 生根的苗会需要更多的营养,但由 于活性炭吸附了一些营养物质,致使苗无法获得足 够的营养物质生长,因此其生根受到抑制.
实验设计了 6 组培养基,并在此基础上以不同 pH 设置 2 个实验组,pH 分别为 7. 0 与 5. 8,故共进 行了 12 组培养基的实验.
表 1 种子萌发培养基 Tab. 1 Different mediums of seed germination
编号 1 2 3 4 5 6 7
配方 1 /2 MS + NAA 1. 0 mg / L 1 /2 MS + 6 - BA 1. 0 mg / L + NAA 0. 1 mg / L 1 /2 MS + 6 - BA 1. 0 mg / L + NAA 0. 2 mg / L 1 /2 MS + 6 - BA 1. 0 mg / L 1 /2 MS + 6 - BA 1. 5 mg / L 1 /2 MS + 6 - BA 2. 0 mg / L 1 /2 MS + 6 - BA 1. 0 mg / L + 1% 活性炭
2 500 lx,光照 16 h / d.
养. 20 d 后观察到有萌发的迹象,种子吸胀,由黄褐
丛生芽诱导培养基是以 MS 为基本培养基,添 色变成绿色,27 d 时便可观察到种子变为绿色小球
加不同浓度的细胞分裂素 6 - BA 和生长素 NAA, 体状,即原球茎,33 d 后原球茎发出绿色的芽尖.
关键词: 白芨; 种子萌发; 组织培养; 培养基 中图分类号: Q 813. 1 文献标识码: A 文章编号: 0258 - 7971( 2010) S1 - 0422 - 05
白芨( Bletilla striata ( Thunb. ) Reichb. f. ) 为 兰科白芨属多年生草本植物. 白芨的块茎为我国传 统中药[1],白芨花色艳丽,也是一种很好的景观植 物,因此市场对白芨的需求十分旺盛. 由于市场需 求的扩大,近年来我国大部分地区的野生白芨遭到 过度采挖,导致其野生自然资源急剧减少,濒临灭 绝,被国家列为重点保护的野生药用植物之一. 为 保护白芨 野 生 资 源,人 工 繁 育 和 栽 培 白 芨 势 在 必 行.
在不含活性炭的培养基中,30 d 后便可观察到 假鳞茎基部出现了许多幼根( 图 1C) ,在生根的同 时,幼苗明显地长高变粗,并且叶片逐渐增多,同时 颜色加深,最后形成了健壮的完整植株. 生根的小
组培苗可以进行炼苗进而移栽到培养室外,逐步驯 化直至实现野外栽培.
在含活性炭的培养基中,白芨苗长势不佳,较 弱小,颜色偏黄,可见活性炭对生根有抑制作用.
无菌播种实验中配制了 2 种不同 pH 值的培 养基,即 5. 8 和 7. 0. 通常植物组织培养实验中,采 用的培养基 pH 值为 5. 8,而 pH 为 7. 0 的培养基被 认为不利于植物生长. 但我们通过实验发现,白芨 在 pH 为 7. 0 的培养基和 pH 为 5. 8 的培养基中, 萌发状况相差不多,同时萌发后白芨苗生长状况良 好,在后续的丛生芽诱导以及根诱导过程中无生长 差异. 当 pH 为 7. 0 时,培养基的硬度较好,不易液 化,对苗的支撑作用好. 因此,在白芨培养体系中可 考虑使用 pH 为 7. 0 的培养基.
3. 1 白芨种子的无菌萌发 本实验白芨的种子在 各培养基上的萌发率均达 90% 以上,除极少数种 子可能因培养基失水而未能吸涨外,均能萌发. 张 建霞等[6]发 现 蒴 果 的 胚 龄 越 长,白 芨 种 子 的 有 胚 率越高. 本研究所用的白芨蒴果为野外采集的已经 成熟但尚未开裂的蒴果,显然是正常有性生殖的类 型,故萌发率高.
摘要: 以白芨成熟蒴果为材料,在不同培养基上进行无菌播种,种子萌发后利用组织培养方法进行无性系 繁殖. 试验结果表明: 种子萌发的最佳培养基为 1 /2 MS + 6 - BA 1. 0 mg / L + 1% 活性炭; 丛生芽增殖的最佳培 养基为 MS + 6 - BA 1. 0 mg / L + NAA 0. 15 mg / L; 不同于已有的研究结果,1 /2MS + 0. 5 mg / L NAA 用于生根的 效果不佳,有待进一步研究.
云 南 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) ,2010,32 ( S1) : 422 ~ 425 Journal of Yunnan University
CN 53 - 1045 / N ISSN 0258 - 7971
*?
白芨的无菌萌发与组织培养
叶 静,郑晓君,管常东,牛 芸,马海英
( 云南大学 生命科学学院,云南 昆明 650091)
第 S1 期
叶 静等: 白芨的无菌萌发与组织培养
425
参考文献:
[1] 《全国中草药汇编》编写组. 中草药汇编( 上册) [M]. 北京: 人民卫生出版社,1976.
[2] 周至明,黄程生,彭丽丽,等. 白及人工种植初步研究 [J]. 中药材,2006,29( 1) : 7-8.
h /d.
中,常存在不同发育时期的原球茎、芽和幼苗.
生根培养基为 1 /2 MS + NAA 0. 5 mg / L + pH 2. 2 丛生芽诱导 1 cm 高的单苗转接到不同的
5. 8 和 1 /2 MS + NAA 0. 5 mg / L + 1% 活性炭 + pH 丛生芽诱导培养基中,15 d 后便可观察到原球茎出
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云南大学学报( 自然科学版)
第 32 卷
图 1 种子无菌萌发( A) ,丛生芽诱导( B) ,生根诱导( C) Fig. 1 The germination of Bletilla striata seed( A) ,Multiple shoot buds induction( B) ,Rooting of tube plantlets( C)
* 收稿日期: 2010 - 06 - 25 作者简介: : 叶静( 1990 - ) ,女,吉林人,云南大学 2007 级生命科学与技术基地班本科生. 通讯作者: 马海英 ( 1971 - ) ,女,博士,主要从事结构植物学与植物发育生物学方面的研究,E - mail: mahy@ ynu. edu. cn.
1 材料与方法
1. 1 植物材料 实验采用的是成熟未开裂的野生 白芨蒴果,采自云南省昆明市嵩明县果东村后山. 1. 2 实验方法
( 1) 无菌播种 将采集的成熟未裂开的蒴果
先用 75% 的酒精表面消毒 30 s,再用 0. 1% 的升汞 ( HgCl2 ) 消毒 10 min,无菌水冲洗 5 ~ 6 次,用无菌 滤纸吸干表面水分. 然后在无菌条件下,用消过毒 的手术刀切开蒴果顶部,用无菌镊子将种子均匀抖 落在培养基上,立即盖上瓶盖,做好标记后,放在培 养箱进行 暗 培 养 5 d,再 移 至 培 养 室,培 养 温 度 ( 25 ± 2) ℃ ,光照度 2 000 ~ 2 500 lx,光照 12 h / d.
第 S1 期
wk.baidu.com
叶 静等: 白芨的无菌萌发与组织培养
423
( 2) 丛生芽增殖 无菌条件下,将约 1 cm 高的单苗 转接到不同的丛生芽诱导培养基中,每种培养基配
2结果
制 5 瓶. 培 养 温 度 ( 25 ± 2 ) ℃ ,光 照 度 2 000 ~ 2. 1 种子无菌萌发 种子播种于培养基上进行培
其中 6 - BA 设置了 0. 5,1. 0,1. 5,2. 0 mg / L 等 4 个
从种子萌发数量来看,4 号与 7 号培养基的种
梯度,而 NAA 的质量浓度均为 0. 15 mg / L,因此培 子萌发率明显高于其它培养基,并且长势较好、萌
养基为 MS + 6 - BA 0. 5 ~ 2. 0 mg / L + NAA 0. 15 发较快,即以单一激素 6 - BA 且其质量浓度为 1. 0
mg / L + pH 5. 8.
mg / L 时萌发效果最好. 其中 7 号培养基的种子萌
( 3) 生根诱导 将诱导出的丛生芽切成单苗 发又明显早于 4 号培养基. 有些原球茎在培养 60d
分别转接到丛生芽诱导培养基和生根培养基上. 培 之后,长出了幼叶,同时很少数的原球茎则会继续
养温度( 25 ± 2) ℃ ,光照度 2 000 ~ 2 500 lx,光照 16 长大但并 不 分 化 出 幼 叶 ( 图 1A) . 在 同 一 培 养 基
6 - BA / ( mg·L - 1 ) NAA / ( mg·L - 1 )
总接种数 /个
总萌芽数 /个
诱导率 /%
0. 5
0. 15
50
16
32
1. 0
0. 15
50
44
88
1. 5
0. 15
50
42
80
2. 0
0. 15
50
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从表 2 可见,6 - BA 质量浓度为 1. 0 mg / L,NAA 为 0. 15 mg / L 时诱导率最高,丛生芽长势较好,诱导 率最高,相 较 于 其 它 不 同 浓 度 的 培 养 基 中 的 苗 健 壮,颜色鲜绿. 6 - BA 浓度较低时,丛生芽诱导系数 降低,苗细小,颜色偏黄. 6 - BA 浓度较高时,也会 使丛生芽诱导率降低,但又比 6 - BA 浓度较低时 的诱导率高. 2. 3 根诱导 在无菌操作条件下,将诱导出的丛 生芽切成约 2 cm 高的单苗分别转接到的两种根诱 导培养基中.
通过实验表明,白芨种子在单一激素 6 - BA 且其质量浓度为 1. 0 mg / L 的培养基中萌发效果最 好,这与袁宁等[7]的结果相似. 此外,本实验对培 养基中添加活性炭的研究表明,活性炭可以有效地 促进白芨种子在基本培养基上的萌发,其萌发率和 萌发速率都明显地高于其他培养基. 3. 2 不同生长调节剂对白芨丛生芽增殖与生根诱 导的影响 根据前人的研究,本实验主要使用了 6 - BA 和 NAA 2 种植物激素. 结果表明,不同浓度 的 6 - BA 对 白 芨 丛 生 芽 的 诱 导 有 很 大 影 响,而 NAA 的影响很小. 当 6 - BA 质量浓度为 1. 0 mg / L 时诱导率最高,这与朱玉球[8]、吴华芬[9]等的结果
白芨的种子非常细小且无胚乳,因此在自然状 况下很难萌发和生长,实生苗的栽培较为困难,传 统栽培主要靠分株繁殖[2 - 5]. 但分株繁殖周期长, 繁殖效率低,而且耗种量大,很难满足大量栽培的 需要. 组织培养技术可以快速繁殖大量种苗,远较 分株繁殖法快捷高效. 本文采用白芨成熟蒴果为材 料,在不同培养基上进行无菌播种,种子萌发后利 用组织培养方法进行无性系繁殖,旨在实现白芨种 苗的规模化生产而探索有效的快速扩繁技术.
5. 8.
现很多个小突起,30 d 左右即可观察到丛生芽长出
以上培养基均含 w ( 蔗糖) = 3% ,w ( 琼脂) ( 图 1B) .
= 0. 9% .
表 2 6 - BA 不同浓度对丛生芽诱导的影响
Tab. 2 Effect of different concentrations of 6 - BA on multiple shoot buds induction
相似. 诱 导 生 根 阶 段,绝 大 多 数 采 用 的 都 是 添 加 NAA,过去对白芨的多项研究也是采用 NAA 诱导 生根[8 - 10]. 本研究也采用 1 /2 MS + NAA 0. 5 mg / L 的培养基进行生根诱导. 但与过去报道的研究结果 不同,本实验采用此培养基的生根效果不够理想. 这可能和兰科植物本身的根发育特性有关,也可能 和实验期间温度降低有关. 为保证移栽的效果,今 后还需要对此进行深入研究. 3. 3 活性炭对白芨组织培养的影响 在植物组织 培养中经常要用到活性炭. 活性炭的加入可以促进 或抑制离体生长. 通过实验发现,加入活性炭有利 于种子的萌发以及白芨幼苗的生长. 而在诱导白芨 苗生根时,活性炭的加入会抑制生根,其原因可能 是因为活性炭会吸附培养基中由白芨生长代谢产 生的有毒物质,从而有利于种子的萌发,以及白芨 幼苗的生 长,但 同 时 活 性 炭 也 会 吸 附 部 分 营 养 物 质,本实验生根培养时使用 1 /2 MS 的培养基,其营 养物质浓度低. 生根的苗会需要更多的营养,但由 于活性炭吸附了一些营养物质,致使苗无法获得足 够的营养物质生长,因此其生根受到抑制.
实验设计了 6 组培养基,并在此基础上以不同 pH 设置 2 个实验组,pH 分别为 7. 0 与 5. 8,故共进 行了 12 组培养基的实验.
表 1 种子萌发培养基 Tab. 1 Different mediums of seed germination
编号 1 2 3 4 5 6 7
配方 1 /2 MS + NAA 1. 0 mg / L 1 /2 MS + 6 - BA 1. 0 mg / L + NAA 0. 1 mg / L 1 /2 MS + 6 - BA 1. 0 mg / L + NAA 0. 2 mg / L 1 /2 MS + 6 - BA 1. 0 mg / L 1 /2 MS + 6 - BA 1. 5 mg / L 1 /2 MS + 6 - BA 2. 0 mg / L 1 /2 MS + 6 - BA 1. 0 mg / L + 1% 活性炭
2 500 lx,光照 16 h / d.
养. 20 d 后观察到有萌发的迹象,种子吸胀,由黄褐
丛生芽诱导培养基是以 MS 为基本培养基,添 色变成绿色,27 d 时便可观察到种子变为绿色小球
加不同浓度的细胞分裂素 6 - BA 和生长素 NAA, 体状,即原球茎,33 d 后原球茎发出绿色的芽尖.
关键词: 白芨; 种子萌发; 组织培养; 培养基 中图分类号: Q 813. 1 文献标识码: A 文章编号: 0258 - 7971( 2010) S1 - 0422 - 05
白芨( Bletilla striata ( Thunb. ) Reichb. f. ) 为 兰科白芨属多年生草本植物. 白芨的块茎为我国传 统中药[1],白芨花色艳丽,也是一种很好的景观植 物,因此市场对白芨的需求十分旺盛. 由于市场需 求的扩大,近年来我国大部分地区的野生白芨遭到 过度采挖,导致其野生自然资源急剧减少,濒临灭 绝,被国家列为重点保护的野生药用植物之一. 为 保护白芨 野 生 资 源,人 工 繁 育 和 栽 培 白 芨 势 在 必 行.
在不含活性炭的培养基中,30 d 后便可观察到 假鳞茎基部出现了许多幼根( 图 1C) ,在生根的同 时,幼苗明显地长高变粗,并且叶片逐渐增多,同时 颜色加深,最后形成了健壮的完整植株. 生根的小
组培苗可以进行炼苗进而移栽到培养室外,逐步驯 化直至实现野外栽培.
在含活性炭的培养基中,白芨苗长势不佳,较 弱小,颜色偏黄,可见活性炭对生根有抑制作用.
无菌播种实验中配制了 2 种不同 pH 值的培 养基,即 5. 8 和 7. 0. 通常植物组织培养实验中,采 用的培养基 pH 值为 5. 8,而 pH 为 7. 0 的培养基被 认为不利于植物生长. 但我们通过实验发现,白芨 在 pH 为 7. 0 的培养基和 pH 为 5. 8 的培养基中, 萌发状况相差不多,同时萌发后白芨苗生长状况良 好,在后续的丛生芽诱导以及根诱导过程中无生长 差异. 当 pH 为 7. 0 时,培养基的硬度较好,不易液 化,对苗的支撑作用好. 因此,在白芨培养体系中可 考虑使用 pH 为 7. 0 的培养基.