结核杆菌的最新研究进展

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结核杆菌诊断技术研究进展
三、分子生物学诊断方法 1 、结核杆茵 结核杆茵DNA扩增法 扩增法(PCR法) 扩增法 法 在过去的20年 已建立起多种PCR技术用来检测结核 在过去的 年，已建立起多种 技术用来检测结核 分枝杆菌特异性的靶序列。实验证明， 是一种简便、 分枝杆菌特异性的靶序列。实验证明，PCR是一种简便、 是一种简便 快速、灵敏、特异的基因诊断技术， 快速、灵敏、特异的基因诊断技术，特别适用于因排菌量 结核杆菌发生L型变异而被常规细菌学检查漏诊者的 少、结核杆菌发生 型变异而被常规细菌学检查漏诊者的 早期诊断、鉴别诊断及化疗后排菌情况的观察， 早期诊断、鉴别诊断及化疗后排菌情况的观察，标本不需 要预培养，有很高的临床诊断价值。虽然PCR技术有诸 要预培养，有很高的临床诊断价值。虽然 技术有诸 多好处，但是目前该方法仍缺少权威性的诊断试剂盒， 多好处，但是目前该方法仍缺少权威性的诊断试剂盒，存 在的主要问题是扩增时气溶胶污染导毁的假阳性、 在的主要问题是扩增时气溶胶污染导毁的假阳性、标本中 PCR抑制物质导致的假阴性，因此还有待进一步改进。 抑制物质导致的假阴性， 抑制物质导致的假阴性 因此还有待进一步改进。
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结核杆菌的最新研究进展
研究生13班 研究生 班 刘红娜 吉尚雷
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结核杆菌的介绍
结核杆菌诊断技术研究进展
பைடு நூலகம்
结核疫苗研究进展 结核疫苗研究未来展望
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结核杆菌的介绍
自从1882年Robert Koch发现结核分枝杆菌 年 自从 发现结核分枝杆菌 (MTB)以来，已报道的分枝杆菌有 以来， 多种。 以来 已报道的分枝杆菌有100多种。有关 多种 分枝杆菌的分类方法很多， 分枝杆菌的分类方法很多，通常分为典型结核分枝 杆菌(TM)和非结核分枝杆菌 和非结核分枝杆菌(NTM)。 杆菌 和非结核分枝杆菌 。 TM包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非 包括人型结核分枝杆菌、 包括人型结核分枝杆菌 牛型结核分枝杆菌、 洲结核分枝杆菌和田鼠分枝杆菌， 洲结核分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，又称为结核分枝 杆菌复合群(MTBC).该群中 该群中DNA相关性为 ％一 相关性为85％ 杆菌复合群 该群中 相关性为 100％，分类地位相近。 ％，分类地位相近。 ％，分类地位相近 NTM包括 包括MTBC和麻风分枝杆菌以外的所有其他分 包括 和麻风分枝杆菌以外的所有其他分 枝杆菌，在自然界中分布广泛，由于NTM对氯化物 枝杆菌，在自然界中分布广泛，由于 对氯化物 具有抗性，它们甚至可以在自来水管道系统中生存。 具有抗性，它们甚至可以在自来水管道系统中生存。
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结核杆菌诊断技术研究进展
1、酶联免疫吸附法 、 由于酶联免疫吸附法(ELSA)简使、 简使、 由于酶联免疫吸附法 简使 易行、快速、无需特殊精密仪器， 易行、快速、无需特殊精密仪器，所 以在结核病血清学诊断方面研究最多、 以在结核病血清学诊断方面研究最多、 应用最广。 应用最广。
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结核杆菌诊断技术研究进展 3、限制性片段长度多态性（PCR—RFLP） 、限制性片段长度多态性（ ） 分子生物学诊断方法PCR—RFLP(限制性片 分子生物学诊断方法 限制性片 段长度多态性)是以 是以PCR为基础的分类鉴定技术 段长度多态性 是以 为基础的分类鉴定技术 和限制性内切酶分析相结合的技术。 和限制性内切酶分析相结合的技术。PCR— RFlJP分析是鉴定分枝杆菌种的可靠程序，比形 分析是鉴定分枝杆菌种的可靠程序， 分析是鉴定分枝杆菌种的可靠程序 态学和生理、生化特征等常规方法更准确，快速。 态学和生理、生化特征等常规方法更准确，快速。
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结核杆菌的介绍
结核是由MTBC中的细菌引起的人畜共患传染病，近 中的细菌引起的人畜共患传染病， 结核是由 中的细菌引起的人畜共患传染病 年来在全球的发病率逐年上升， 年来在全球的发病率逐年上升，特别是发现了由牛结核分 枝杆菌引起的人类结核和由MAC引起的肺炎有增多的趋 枝杆菌引起的人类结核和由 引起的肺炎有增多的趋 已成为值得关注的公共卫生问题。研究表明， 势，已成为值得关注的公共卫生问题。研究表明，结核病 牛可通过痰液、乳汁、粪便等向外排出结核杆菌污染环境。 牛可通过痰液、乳汁、粪便等向外排出结核杆菌污染环境。 因此，动物检疫是控制结核病的重要环节。 因此，动物检疫是控制结核病的重要环节。 结核是一种慢性消耗性疾病，每年引起全球约300万 结核是一种慢性消耗性疾病，每年引起全球约 万 人死亡。 世纪 年代后结核病的发病率曾有所降低， 世纪80年代后结核病的发病率曾有所降低 人死亡。20世纪 年代后结核病的发病率曾有所降低， 但近年其全球疫情又呈现上升趋势，而且由于结核分枝杆 但近年其全球疫情又呈现上升趋势， 菌耐药性和多重耐药菌株的出现， 菌耐药性和多重耐药菌株的出现，结核病对某些国家已构 成严重的健康威胁。因此，对结核杆菌的研究非常重要。 成严重的健康威胁。因此，对结核杆菌的研究非常重要。
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结核杆菌诊断技术研究进展 二、血清学检测 多数血清学实验检测时间短，具有较高的特异性。 多数血清学实验检测时间短，具有较高的特异性。 可用于人群筛选。 可用于人群筛选。但日前已商品化的组合抗原检 测试剂盒都无法检测出所有结核患者血清中的抗 结核抗体。结核分枝杆菌抗原多且复杂， 结核抗体。结核分枝杆菌抗原多且复杂，在宿主 体内表达的数量、 体内表达的数量、种类或时机可能随患者的个体 免疫背景和病程而异，从而表现出不同的抗体谱。 免疫背景和病程而异，从而表现出不同的抗体谱。 因此，采用多种抗原联合检测的手段， 因此，采用多种抗原联合检测的手段，在保证特 异性的基础上有助于改善灵敏低的缺点。 异性的基础上有助于改善灵敏低的缺点。
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结核杆菌诊断技术研究进展 4、噬茵体报告技术 、 该技术原理为， 该技术原理为，萤光素酶指示的分枝杆菌噬菌体 与在含抗结核药物培养基中短暂培养的待检菌混 合后，能感染活的耐药菌， 合后，能感染活的耐药菌，使之表达萤光素酶基 再加入萤光素底物，活菌会产生荧光， 因，再加入萤光素底物，活菌会产生荧光，而敏 感菌无荧光产生。此办法直观性高、用时短， 感菌无荧光产生。此办法直观性高、用时短，但 如要被广泛应用于结核杆菌的快速检测还需要进 一步的探索．必须使用标准化的细菌、标准化的 一步的探索．必须使用标准化的细菌、 萤光素酶系统， 萤光素酶系统，以及标准化的培养基和发光检测 并能与用常规方法所测最低抑菌浓度值相符。 仪，并能与用常规方法所测最低抑菌浓度值相符。
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结核杆菌诊断技术研究进展 2、实时荧光定量PCR技术 、实时荧光定量 技术 实时荧光定量PCR技术具有引物和探针的双 实时荧光定量 技术具有引物和探针的双 重特异性。与传统PCR相比，在对结核分枝杆菌 相比， 重特异性。与传统 相比 检测的特异性上大为提高。尽管实时荧光定量 检测的特异性上大为提高。尽管实时荧光定量 PCR技术在结核分枝杆菌检测方面有许多优势， 技术在结核分枝杆菌检测方面有许多优势 技术在结核分枝杆菌检测方面有许多优势， 但由于其高灵敏性、 但由于其高灵敏性、实验操作易受污染等而容易 出现假阳性。只要有微量病原体存在， 出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增 扩增 即可为阳性结果，故并不能作为诊断依据，只有 即可为阳性结果，故并不能作为诊断依据， 当一定数量的病原体存在时才有临床意义。 当一定数量的病原体存在时才有临床意义。
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结核杆菌诊断技术研究进展 2、斑点金标免疫渗滤法 、 斑点金标免疫渗滤法(DIGFA)是将固相人型结 斑点金标免疫渗滤法 是将固相人型结 核分枝杆菌蛋白衍生物(PPD)纯化抗原包被在斑 核分枝杆菌蛋白衍生物 纯化抗原包被在斑 点反应板上， 点反应板上，其与体液中的抗结核分枝杆菌抗体 (PPD—IgG)形成复合物．胶体金标记抗人 形成复合物． 形成复合物 胶体金标记抗人IgG 或海藻硫酸多糖(SPA)与复合物结合，形成肉眼 与复合物结合， 或海藻硫酸多糖 与复合物结合 可见的红色斑点。这种方法具有简便、快速、 可见的红色斑点。这种方法具有简便、快速、结 果易于判读、无需特殊仪器、 果易于判读、无需特殊仪器、能进行单个标本的 测定、受检患者可及时得到结果等特点。 测定、受检患者可及时得到结果等特点。但受结 核菌或其他分枝杆菌感染及卡介苗接种等影响， 核菌或其他分枝杆菌感染及卡介苗接种等影响， 可能出现交叉反应。 可能出现交叉反应。
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结核杆菌诊断技术研究进展 3、MB／BacT系统 、 ／ 系统 MB／BacT系统是由德国 系统是由德国Heipha— ／ 系统是由德国 Biotest公司生产的一种液体培养基系统， 公司生产的一种液体培养基系统， 公司生产的一种液体培养基系统 该系统对标本中结核分枝杆菌复合群 (MTBC)初代分离率高于全自动分枝杆菌检 初代分离率高于全自动分枝杆菌检 测系统(BACTE)TB460，可以通过肉眼观 测系统 ， 察到细菌生长，且无放射性污染.但不能用 察到细菌生长，且无放射性污染 但不能用 于分支杆菌的菌型鉴定。
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结核杆菌诊断技术研究进展 2、分枝杆菌生长指示系统(MGIT) 、分枝杆菌生长指示系统 MGIT系统是继全自动分枝杆菌检测系统 系统是继全自动分枝杆菌检测系统 (BACTIEC)检测系统之后发明的一种非放射性 检测系统之后发明的一种非放射性 培养法，包括MiddleBrood 7H9液体培养基 培养法，包括 液体培养基 和分枝杆菌生长指示剂， 和分枝杆菌生长指示剂，该指示剂在有氧条件下 发生荧光淬灭。 发生荧光淬灭。当培养基中分枝杆菌生长代谢逐 渐消耗氧时，培养基的氧化还原电势降低， 渐消耗氧时，培养基的氧化还原电势降低，指示 剂发出荧光．这样可通过紫外线透射仪观察，分 剂发出荧光．这样可通过紫外线透射仪观察， 枝杆菌生长所产生的荧光在气液面及试管底部呈 橙色即为阳性结果。 橙色即为阳性结果。
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结核杆菌诊断技术研究进展 3、结明实验 、 结明实验(MycoDot)是国内外使用较早、较普 结明实验 是国内外使用较早、 是国内外使用较早 遍的结核抗体快速检测实验。 遍的结核抗体快速检测实验。将脂阿拉伯甘露聚 作为抗原固定在电泳梳上， 糖(LAM)作为抗原固定在电泳梳上，再将此附有 作为抗原固定在电泳梳上 抗原的电泳梳于稀释的血清或全血中浸泡， 抗原的电泳梳于稀释的血清或全血中浸泡，标本 中如有LAM抗体，则与梳上 抗体， 抗原相结合， 中如有 抗体 则与梳上LAM抗原相结合， 抗原相结合 浸入显色液后， 浸入显色液后，抗体会颗粒便会特异性地聚集在 抗原抗体复合物上， 抗原抗体复合物上，在梳上附着抗原处形成红色 圆形斑点，即为阳性。 圆形斑点，即为阳性。结核菌细胞壁成份中含有 阿拉伯甘露糖． 阿拉伯甘露糖．因此只有当患者患活动性结核病 才会有阳性反应。健康人、 时，才会有阳性反应。健康人、既往感染者以及 卡介苗接种者都显示为阴性。 卡介苗接种者都显示为阴性。
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结核杆菌诊断技术研究进展 结核杆菌诊断技术研究进展 一、细菌学检测 结核病人的细菌学检测是结核病诊断、 结核病人的细菌学检测是结核病诊断、治疗及 评价治疗效果的可靠手段。在过去的20年中 年中， 评价治疗效果的可靠手段。在过去的 年中，针 对结核分枝杆菌的早期感染已经建立了一系列快 速检测系统。 速检测系统。 1 、全自动分枝杆菌检测系统（BACTEC） 全自动分枝杆菌检测系统（ ） 该法采用放射同位素技术对细菌的生长进行 自动检测。该法检测的阳性率比L-j法提高了 法提高了10 自动检测。该法检测的阳性率比 法提高了 ％，但其局限性在于无法观察菌落形态 但其局限性在于无法观察菌落形态、 ％，但其局限性在于无法观察菌落形态、容易污 有放射性及价格昂贵。 染、有放射性及价格昂贵。