绿色木霉代谢产物对黑曲霉和荔枝炭疽抑菌机理的研究(透射电镜)

绿色木霉代谢产物对黑曲霉和荔枝炭疽抑菌机理的研究

蔚慧,杨林华,李志民　(邯郸职业技术学院管理系,食品工程教研室,河北邯郸056001)

摘要　[目的]分析绿色木霉代谢产物对黑曲霉和荔枝炭疽抑菌机理。[方法]采用培养皿对峙培养、载片培养观察和透射电镜观察法分析黑曲霉和荔枝炭疽菌丝被绿色木霉代谢物拮抗后的变化。[结果]黑曲霉菌丝内部的细胞膜、线粒体、细胞核、细胞质等各种细胞器都已经消失或变形或干瘪;荔枝炭疽菌丝内部的液泡已经膨胀变形,线粒体和叶绿体经代谢物作用后分化成细小的颗粒,细胞核也变形,细胞质变成了胶体状态。[结论]黑曲霉和荔枝炭疽菌丝都不同程度变形,说明绿色木霉代谢物是一种重要的抑菌剂。关键词　绿色木霉;代谢产物;黑曲霉;荔枝炭疽;抑菌机理中图分类号　S436.611 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2009)31-15144-02Research on the Antibacter i al M echan is m of T .viride M et abolites aga i n st Aspergillus n iger and Colletotrictum gloeos Y U Hui et al (Depart m ent of Management,Handan Polytechnic College,Handan,Hebei 056001)

Abstract [Objective ]The research ai med to analyze the antibacterial mechanis m of T .viride metabolites against Aspergillus niger and Colleto 2trictum gloeos .[Method ]U sing the methods of culture dish confr onting cultivation,slide cultivation observation and TE M,the changes of Aspergil 2lus niger and Colletotrictum gloeos antagonized by T .viride were analyzed .[Result]The myceliu m,membrane,m it ochondria,nucleus,cyt op las m and other organelles of Aspergillus niger have disappeared or defor med .The silk of Colletotrictum gloeos has been expanded .The m itochondria and chlor oplasts have been differentiated int o s mall granules .The nucleus has been def or med .The cyt op las m has been colloidal status .[Conclusion ]Mycelial of Aspergillus niger and Colletotrictum gloeos have been def or med to different extent,which indicated that T .viride metabolites was an i m 2portant antibacterial agent .

Key words T .viride ;Metabolites;Aspergillus niger ;Colletotrictum gloeos ;Antibacterial mechanis m

作者简介　蔚慧(1978-),女,河北邯郸人,硕士,讲师,从事食品科学

与工程方面的教学及科研工作。

收稿日期　2009207206

绿色木霉(T .viride )是一类分布广泛的土壤习居菌,常见于植物残体及动物粪便上。除个别为弱病原菌外,大多数对果蔬病菌具有拮抗作用

[1-2]

。绿色木霉具有广泛适应性、

拮抗多样性和寄生广谱性,是一种很有潜力的生防菌。

利用绿色木霉代谢物对黑曲霉和荔枝炭疽2种病原菌进行拮抗试验,发现黑曲霉和荔枝炭疽均受到绿色木霉代谢物抑制,并且抑制效果显著。为进一步探求抑菌机理,通过透射电镜观察黑曲霉和荔枝炭疽,发现黑曲霉和荔枝炭疽菌丝经绿色木霉代谢物处理后,内部均发生细胞学变化。

1　材料与方法1.1　材料

1.1.1　供试菌株。绿色木霉A 菌株,病原菌为黑曲霉B 菌

株和香蕉炭疽菌C 菌株(均来自于华南农业大学)。

1.1.2　仪器和药品。JE M 21230透射电镜观察,O ly mpus 2dp70摄影显微镜。无菌蒸馏水、3%戊二醛、磷酸缓冲液、1%

的氧化锇、100%的丙酮、醋酸双氧铀、构像铅。

1.2　方法

1.2.1　绿色木霉代谢产物的制备。将绿色木霉在P DA 上培

养5d 后,刮去培养基表面的菌丝和孢子,用玻璃棒将剩下的培养基搅碎并加入无菌蒸馏水,浸泡、过滤,再进行超滤,重复几次,直到过滤后的滤渣重新做成培养基和新鲜的P DA 培养基培养出的致病菌菌落半径大小相差不显著为止;并用旋转蒸发仪于50℃、0.01MPa 将滤液浓缩至原培养基重量的1/10,备用

[3]

。

1.2.2　改良P DA 培养基。将绿色木霉代谢产物浓缩液按1∶5加入到新鲜的P DA 培养基中,灭菌,备用

[4]

。

1.2.3　培养皿对峙培养。用d =5mm 的打孔器切取培养5d 同质等量的绿色木霉和病原菌的菌丝块,接种于P DA 平板

上距中心2c m 处同一直线的两点上,同时设只接种病原菌

为对照,每处理3次重复,于30℃恒温培养,并逐日观察

[5]

。

当两菌落接触相交后,观察记载绿色木霉对病原菌的抑制、包围、侵入并占领其营养空间的过程。当两菌落交接后,在交接部位或病菌菌落内部挑取菌丝在显微镜下观察二者的相互作用

[6]

。

代谢物抑菌平板对峙培养:将致病菌接种于改良P DA 培养基中心,同时设接种于P DA 为对照,每处理3个重复,于

30℃恒温培养,并逐日观察

[7]

。当菌落半径达到培养皿半

径的1/2时,挑取边缘和中心的菌丝在显微镜下观察两菌丝的形态变化。

1.2.4　载片培养观察。参考高克祥等的试验方法,用灭菌

的解剖刀划取15mm ×10mm 的P DA,置于灭菌的载片中央,然后挑取等量绿色木霉和病原菌的菌丝分别接种于P DA 膜两平行边的中点,在25℃恒温下保湿培养,逐日镜检观察两菌的相互作用。用O ly mpusI 2dp70摄影显微镜拍摄显微照片。同理也在改良P DA 培养基上接种、观察、显微拍照

[8]

。

1.2.5　透射电镜观察。参考Cha mbers 等试验方法,改用载

片培养法。5d 后,当在光学显微镜下观察代谢物抑制现象时,用竹签将荔枝炭疽菌的菌丝扭曲成球,之后用无菌镊子夹注放入3%戊二醛(0.1mol/L 磷酸缓冲液,pH 值7.0)中

2h,同时用玻璃刀切取在P DA 膜边缘长有黑曲霉菌丝的小

块玻璃片放入在3%戊二醛中2h,将各处理分别用1/15

mol/L 的磷酸缓冲液漂洗2次,用1%的氧化锇固定1h,之

后再漂洗2次,每次10m in;样品再用乙醇系列浓度(50%、

70%、80%、90%、100%)逐级脱水,每级处理10m in,再用100%的丙酮漂洗2次

[9]

;用S pon812∶100丙酮=1∶1溶液渗

透2h,再经纯S pon812包埋[10]

;将各级处理在35℃、24h,45

℃、12h,65℃、24h 聚合[11];修片;用LK B 2V 超薄切片;用醋

酸双氧铀、构像铅双染色

[12]

。用日本产的JE M 21230透射电

镜,于25k V 电压下观察,并拍摄照片[13]

。

2　结果与分析

2.1　对峙培养中菌丝生长和相互作用　对峙培养中,从宏

责任编辑　熊章琴　责任校对　卢瑶

安徽农业科学,Journal of Anhui Agri .Sci .2009,37(31):15144-15145,15242