基因克隆简介
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第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的 利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。
3、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质 粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与 松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。 4、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质 粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现 象。
2）天然质粒的局限性
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。
3.2 DNA ligase的特点 1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
（1）分子量大，拷贝数低
第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101， 分子长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充 当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基 因的内部。
3）发展概况
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA 复制起点（ori）。
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
SalI
pBR322
(4.36 kb)
ori
pBR322质粒载体优点：
第一，具有较小的分子量。pBR322质粒DNA分 子为4 363bp。
第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子 的选择记号。
1.4 II类限制性内切酶
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流 感嗜血菌中分离出来。
分离的第一个酶是 Hind Ⅱ
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多 数是回文序列）。 与DNA的来源无关。
（2）切割位点
从识别位点处
切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或 平齐末端（blunt end）。如：
EcoR I 5’-GAATTC-3’ EcoR V 5’-GATATC-3’
3’-CTTAAG-5’
3’-CTATAG-5’
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
产生粘性末端
Sam I 5’-GGG CCC-3’
3’-CCC GGG-5
产生平齐末端
（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。
（4） 构建cDNA文库的一般步骤
（1）总RNA（total RNA）提取
提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。
（2）mRNA的分离纯化
（3）cDNA的合成
用Oligo dT（或随机引物）作引物，逆 转录酶能以RNA为模板合成cDNA。
原位杂交主要用来从用质粒或 Cosmid 构建的基 因文库中寻找阳性克隆，当得到阳性克隆后，再通 过 Southern 杂交进一步验证。通过这种方法在一 张直径为 9cm 的滤膜上，可检测成几百到一千甚至 上万个菌落，达到高通量筛选的目的。
原位杂交
2） cDNA文库的构建
（1） cDNA
以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
N端的11-41aa pUC lacZ’
C端大部分 受体菌lacZ
⑥ a互补的插入失活
pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS) 区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源 基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。
b-半乳糖苷酶 Xgal
半乳糖
5-溴-4-氯靛蓝
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
⑤ 载体lacZ’与a互补
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA 反转录酶
3’
（2） cDNA library
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些 cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩 增，称cDNA文库。
（3） cDNA文库的特点
（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。
2. 连接条件
（1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA3’端有游离的-OH，
5’端有一个磷酸基团（P）。
（3）需要能量
动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
三. 分子克隆的载体
基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一 段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外 源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。
基因克隆简介
一. DNA分子克隆的基本原理
基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组 ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源 的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合 分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成 大量的子代DNA分子的过程。
克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性 繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性 繁殖系的过程(cloning)。
（2） 基因组文库的构建
1、提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大小 的 DNA 片段， 2、载体DNA的制备； 3、DNA 片段与载体连接与包装 ； 4、重组噬菌体侵染受体菌； 5、基因文库的鉴定和扩增
（3 ）基因文库的筛选
原位杂交，是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌 种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜 上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放出来，并使之 固定在滤膜上并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交 作用。
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤
１.获得待克隆的DNA片段（基因）； ２.目的基因与载体在体外连接； ３.重组DNA分子导入宿主细胞； ４.筛选、鉴定阳性重组子； ５.重组子的扩增与／或表达。
1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因 的DNA片段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自 我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重 组DNA分子。
多克隆位点
polylinker
复制起始点 ori
遗传标记
Amp
常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，病 毒，BAC，YAC等。
1.质粒(plasmid )载体
Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。
Plasmid
chromosome
1） 质粒的一般生物学特性
1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA 分子。
2.7kb
lacZ的a肽互补蓝白斑选择原理：
① 乳糖操纵子
ＰＯ
Z编码β-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄 糖和半乳糖。
② 异丙基硫代半乳糖苷
异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside：IPTG）结构上类似于别乳糖， 是乳糖操纵子非常有效的诱导物。可诱导lac操 纵子表达，但不能被β-半乳糖苷酶水解。
第三，具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增 之后，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。这就 为重组DNA的制备提供了极大的方便。
Amp Tet
pBR322
插入片段
Tet平板
Amp平板
wenku.baidu.com抗药性标志的选择
第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多 克隆位点区和新的筛选标记基因。如pUC系列载体。
载体具以下特征：
1) 具有自主复制能力； 2）有可选择的标记基因（如，抗药基因） 3）有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一
切点； 4）分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入
宿主细胞并在其中增殖；被切割后的载体，插入外 源DNA后，不影响其复制能力 5）使用安全。克隆载体应只存在有限范围的宿主， 在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状， 并且不能离开宿主自由扩散。
Escherichia
Coli Ry13
EcoR I
属名
种类 株系
编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的 第一和第三个字母。
如Hind Ⅲ代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzac) d株中分离到的第3个限制酶。
1.3、限制性核酸内切酶的分类
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰 活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。 I 类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。 Ⅱ类：基因工程的工具酶。 Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点 25 bp～27 bp，对分子克隆操作亦无实用意义。
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称 寄主细胞）并与之一起增殖。
4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组 DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的 目的基因。
5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞， 使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人 类所需要的物质。
限制性内切酶
能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来 DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称 为限制性核酸内切酶。
1.2、限制性核酸内切酶的命名原则
限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案， 即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字 母，大写；第2，3二个字母取自它来源细菌的种名 的头2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则 有第4个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株 中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。
IPTG
Isopropyl-beta-Dthiogalactoside
异丙基 硫代 -β-D-半乳糖 苷
③ Xgal
（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖糖苷
b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解 成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛 蓝。
5’ MCS lacZ’ 3’ 5’ 外源DNA lacZ’ 3’
a肽 互补
a肽移码突变 不互补
IPTG诱导的结果： MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道 是否有DNA插入。
第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的 不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动 子载体，表达型载体及各种探针型载体。
二. 用于基因克隆的工具酶
1. DNA限制性内切酶
1.1、限制酶概念提出的背景
20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体 不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“ 限制现象”。
1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象 。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是 核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位 ，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，另 一种是修饰酶，可对自生的DNA进行修饰。
Ampr
lacZ’ T7启动子 MCS SP6启动子
ori
四. DNA 的克隆过程 1.目的基因片段的获得
1）基因文库的构建
（1） 基因文库（gene library）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大 小合适的片断，并将所有这些片断都与适当 的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和 扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体 的全部基因，称为基因文库。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。
3、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质 粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与 松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。 4、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质 粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现 象。
2）天然质粒的局限性
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。
3.2 DNA ligase的特点 1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
（1）分子量大，拷贝数低
第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101， 分子长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充 当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基 因的内部。
3）发展概况
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA 复制起点（ori）。
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
SalI
pBR322
(4.36 kb)
ori
pBR322质粒载体优点：
第一，具有较小的分子量。pBR322质粒DNA分 子为4 363bp。
第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子 的选择记号。
1.4 II类限制性内切酶
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流 感嗜血菌中分离出来。
分离的第一个酶是 Hind Ⅱ
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多 数是回文序列）。 与DNA的来源无关。
（2）切割位点
从识别位点处
切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或 平齐末端（blunt end）。如：
EcoR I 5’-GAATTC-3’ EcoR V 5’-GATATC-3’
3’-CTTAAG-5’
3’-CTATAG-5’
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
产生粘性末端
Sam I 5’-GGG CCC-3’
3’-CCC GGG-5
产生平齐末端
（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。
（4） 构建cDNA文库的一般步骤
（1）总RNA（total RNA）提取
提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。
（2）mRNA的分离纯化
（3）cDNA的合成
用Oligo dT（或随机引物）作引物，逆 转录酶能以RNA为模板合成cDNA。
原位杂交主要用来从用质粒或 Cosmid 构建的基 因文库中寻找阳性克隆，当得到阳性克隆后，再通 过 Southern 杂交进一步验证。通过这种方法在一 张直径为 9cm 的滤膜上，可检测成几百到一千甚至 上万个菌落，达到高通量筛选的目的。
原位杂交
2） cDNA文库的构建
（1） cDNA
以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
N端的11-41aa pUC lacZ’
C端大部分 受体菌lacZ
⑥ a互补的插入失活
pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS) 区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源 基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。
b-半乳糖苷酶 Xgal
半乳糖
5-溴-4-氯靛蓝
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
⑤ 载体lacZ’与a互补
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA 反转录酶
3’
（2） cDNA library
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些 cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩 增，称cDNA文库。
（3） cDNA文库的特点
（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。
2. 连接条件
（1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA3’端有游离的-OH，
5’端有一个磷酸基团（P）。
（3）需要能量
动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
三. 分子克隆的载体
基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一 段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外 源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。
基因克隆简介
一. DNA分子克隆的基本原理
基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组 ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源 的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合 分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成 大量的子代DNA分子的过程。
克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性 繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性 繁殖系的过程(cloning)。
（2） 基因组文库的构建
1、提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大小 的 DNA 片段， 2、载体DNA的制备； 3、DNA 片段与载体连接与包装 ； 4、重组噬菌体侵染受体菌； 5、基因文库的鉴定和扩增
（3 ）基因文库的筛选
原位杂交，是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌 种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜 上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放出来，并使之 固定在滤膜上并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交 作用。
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤
１.获得待克隆的DNA片段（基因）； ２.目的基因与载体在体外连接； ３.重组DNA分子导入宿主细胞； ４.筛选、鉴定阳性重组子； ５.重组子的扩增与／或表达。
1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因 的DNA片段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自 我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重 组DNA分子。
多克隆位点
polylinker
复制起始点 ori
遗传标记
Amp
常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，病 毒，BAC，YAC等。
1.质粒(plasmid )载体
Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。
Plasmid
chromosome
1） 质粒的一般生物学特性
1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA 分子。
2.7kb
lacZ的a肽互补蓝白斑选择原理：
① 乳糖操纵子
ＰＯ
Z编码β-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄 糖和半乳糖。
② 异丙基硫代半乳糖苷
异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside：IPTG）结构上类似于别乳糖， 是乳糖操纵子非常有效的诱导物。可诱导lac操 纵子表达，但不能被β-半乳糖苷酶水解。
第三，具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增 之后，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。这就 为重组DNA的制备提供了极大的方便。
Amp Tet
pBR322
插入片段
Tet平板
Amp平板
wenku.baidu.com抗药性标志的选择
第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多 克隆位点区和新的筛选标记基因。如pUC系列载体。
载体具以下特征：
1) 具有自主复制能力； 2）有可选择的标记基因（如，抗药基因） 3）有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一
切点； 4）分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入
宿主细胞并在其中增殖；被切割后的载体，插入外 源DNA后，不影响其复制能力 5）使用安全。克隆载体应只存在有限范围的宿主， 在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状， 并且不能离开宿主自由扩散。
Escherichia
Coli Ry13
EcoR I
属名
种类 株系
编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的 第一和第三个字母。
如Hind Ⅲ代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzac) d株中分离到的第3个限制酶。
1.3、限制性核酸内切酶的分类
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰 活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。 I 类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。 Ⅱ类：基因工程的工具酶。 Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点 25 bp～27 bp，对分子克隆操作亦无实用意义。
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称 寄主细胞）并与之一起增殖。
4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组 DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的 目的基因。
5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞， 使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人 类所需要的物质。
限制性内切酶
能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来 DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称 为限制性核酸内切酶。
1.2、限制性核酸内切酶的命名原则
限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案， 即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字 母，大写；第2，3二个字母取自它来源细菌的种名 的头2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则 有第4个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株 中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。
IPTG
Isopropyl-beta-Dthiogalactoside
异丙基 硫代 -β-D-半乳糖 苷
③ Xgal
（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖糖苷
b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解 成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛 蓝。
5’ MCS lacZ’ 3’ 5’ 外源DNA lacZ’ 3’
a肽 互补
a肽移码突变 不互补
IPTG诱导的结果： MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道 是否有DNA插入。
第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的 不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动 子载体，表达型载体及各种探针型载体。
二. 用于基因克隆的工具酶
1. DNA限制性内切酶
1.1、限制酶概念提出的背景
20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体 不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“ 限制现象”。
1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象 。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是 核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位 ，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，另 一种是修饰酶，可对自生的DNA进行修饰。
Ampr
lacZ’ T7启动子 MCS SP6启动子
ori
四. DNA 的克隆过程 1.目的基因片段的获得
1）基因文库的构建
（1） 基因文库（gene library）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大 小合适的片断，并将所有这些片断都与适当 的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和 扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体 的全部基因，称为基因文库。