王镜岩-生物化学I-第14章 核酸的物理化学性质—第15章 核酸的研究方法
王镜岩核酸的物理化学性质
核
苷
酸离
的
子 化
解
程 度
离
曲
线
鸟嘌呤核苷酸
pK2 = 3.7
含氮环 pK3 = 6.1
pK1 = 0.7
第二磷酸基
第一磷酸基
烯醇式羟基
pK2 = 4.3 含氮环
胞嘧啶核苷酸
pK1 = 0.8 第一磷酸基
pK3 = 6.3 第二磷酸基
pK1 = 1.0 第一磷酸基
尿嘧啶核苷酸
pK3 = 6.4 第二磷酸基
2020/9/22
影响DNA的Tm值的因素
①DNA均一性 。 均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA 的均一性 。 ②G-C含量与Tm值成正比。 测定Tm，可推知G-C含量。 G-C%=（Tm-69.3）×2.44
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③介质中离子强度 离子强度高，Tm高。
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利用酸水解可以研究核酸的碱基组成
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（二）碱水解
RNA的磷酸酯键对碱敏感
室温，0.3～1mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解， 得到2′-或3′-核苷酸的混合物。
DNA抗碱水解 生理意义：
DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。
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或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸 3、判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）
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四、核酸的变性、复性及杂交
(一)变性
核酸变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链， 不涉及共价键断裂。
15 核酸的物理化学性质-王镜岩生物化学(全)
（3）低盐变性：<0.01mol/l时，由于 磷酸基的静电斥力，可以配对的碱 基无法相互靠近。 （4）变性剂：尿素 、甲醛 ，可以打 开氢键
2. 核酸变性的特点
• （1）一系列物化性质也随之发生改变 ： 紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密 度升高，酸碱滴定曲线改变等 • （2） 变性作用发生在一个很窄的温度 范围内 。 • 通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去 一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温 度，用Tm表示。DNA的Tm值一般在82— 95℃之间
(3) 限制性内切酶
限制性核酸内切酶：存在于细菌体内的，专门降
解外源 DNA ，是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种
特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内 切酶。 往往与一种甲基化酶同时成对地存在。识别相 同的碱基序列，当内切酶作用位点上的某一些碱基
被甲基化修饰后，限制酶就不能再降解这种DNA了。
1. 引起核酸变性的因素
（1）热变性：加热使氢键断裂，碱基分子内 能升高，碱基堆积力减小，使用最广泛。缺 点是高温可能引起酯键断裂，得到长短不一 的单链DNA；80～100℃ （2）酸碱变性：在pH<4.5或pH>11即可引起变 性。在制备单链DNA时优先采取pH=11.3的碱 变性，全部氢键都被淘汰。
（2）、有足够的温度以破坏无规则的
链内氢键，但又不能太高，否则配对碱 基之间的氢键又难以形成，一般用比Tm低
20--25℃的温度。
将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能
复性。缓慢冷却时，可以复性---退火。
（3）、DNA的性质也影响复性
DNA的片段越大，复性越慢。
DNA的浓度越大，复性越快。
重复序列越多，复性越快。
14 核酸的结构-王镜岩生物化学(全)
• 外显子：翻译的序列。 • 假基因：是与已知基因在不同部位有密切相
似形的基因，但由于结构上有加入或缺失因而 阻止了正常转录或翻译，使之无功能。
• 回文结构：具有链内互补的碱基顺序，颠倒
重复存在于另一条链上 。 --CATGAACGTCCTATTGGACGTTCTGA---GTACTTGCAGGATAACCTGCAAGACT--
嘧 啶 碱 戊 糖 酸
胞嘧啶(cytosine) 胞嘧啶(cytosine) 胸腺嘧啶(thymine) 尿嘧啶(uracil) 、T D-2-脱氧核糖 D-核糖 磷 酸 磷 酸
第一节
核苷酸
核苷酸的分类：
• （1）(核糖)核苷酸• （2）脱氧(核糖)核苷酸两类。 • 两者基本化学结构相同，只是所含 戊糖不同。
• 染色质的基本结构单位——核小体
染色质的基本结构——核小体(nucleosome)
1974年Kornberg 根据电镜观察和 X射线衍射等资 料，提出核小体 的结构
核小体的结构模型特点
• 1. 由组蛋白核心 和盘绕其上的 DNA所构成；组 蛋白H1将DNA两 条链封住。 • 2.核心由组蛋白 H2A、H2B、H3 和H4各2分子组 成一个八聚体； • 3. DNA以左手螺 旋在组蛋白核心 上盘绕1.8圈，共 146 bp
Chargaff规则（1950年总结）
• (1) 腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即A=T。 • (2) 鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数也相等，即G=C。 • (3) 含氨基的碱基(腺嘌呤和胞嘧啶)总数等于含酮 基的碱基(鸟嘌吟和胸腺嘧啶)总数，即A+C=G+T。 • (4) 嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T。
核酸 王镜岩《生物化学》第三版笔记(打印版)
第六章核酸提要一.概述核酸分类分布与功能二.核苷酸碱基嘌呤与嘧啶DNA与RNA中的核苷与核苷酸多磷酸核苷酸环核苷酸三.DNA的结构磷酸二酯键DNA的一级结构DNA的二级结构DNA的三级结构DNA的拓扑结构四.RNA的结构DNA与RNA的区别RNA的种类与功能tRNA的结构特点mRNA的结构特点五.核酸的理化性质紫外吸收DNA的变性与复性限制性内切酶第一节概述一发现核酸占细胞干重的5－15％，1868年被瑞士医生Miescher发现，称为“核素”。
在很长时间内，流行“四核苷酸假说”，认为核酸是由等量的四种核苷酸构成的，不可能有什么重要功能。
1944年Oswald Avery通过肺炎双球菌的转化实验首次证明DNA是遗传物质。
正常肺炎双球菌有一层粘性发光的多糖荚膜，有致病性，称为光滑型（S型）；一种突变型称为粗糙型（R型），无荚膜，没有致病能力（缺乏UDP-葡萄糖脱氢酶）。
1928年，格里菲斯发现肺炎双球菌的转化现象，即将活的粗糙型菌和加热杀死的光滑型菌混合液注射小鼠，可致病，而二者单独注射都无致病性。
这说明加热杀死的光滑型菌体内有一种物质使粗糙型菌转化为光滑型菌。
艾弗里将加热杀死的光滑型菌的无细胞抽提液分级分离，然后测定各组分的转化活性，于1944年发表论文指出“脱氧核糖型的核酸是型肺炎球菌转化要素的基本单位”。
其实验证据如下：DNA组成非常接近。
DNA的相似。
RNA酶处理也不不影响其转化活性。
酶可使其转化活性丧失。
艾弗里的论文发表后，有些人仍然坚持蛋白质是遗传物质，认为他的分离不彻底，是混杂的微量的蛋白质引起的转化。
1952年，Hershey和Chase的T2噬菌体旋切实验彻底证明遗传物质是核酸，而不是蛋白质。
他们用35S标记蛋白质，用32P标记核酸。
用标记的噬菌体感染细菌，然后测定宿主细胞的同位素标记。
当用硫标记的噬菌体感染时，放射性只存在于细胞外面，即噬菌体的外壳上；当用磷标记的噬菌体感染时，放射性在细胞内，说明感染时进入细胞的是DNA，只有DNA是连续物质，所以说DNA是遗传物质。
王镜岩生化第三版考研课件 第15章 核酸的研究方法
3,定磷法 , 核酸含磷量为9.5% 核酸含磷量为 1g磷相当于 磷相当于10.5g核酸 磷相当于 核酸 4,琼脂糖凝胶电泳 , 溴乙锭能插入 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物 能插入 分子的碱基 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比 荧光强度与 含量成正比
(四),核酸纯度的测定 OD260/OD280
y = (1+ x)
n
y=产物;x=扩增效率;n=循环次数 产物; 扩增效率 扩增效率; = 产物
靶DNA的扩增 DNA的扩增
5' (a) (b) 引物2 引物2 5' 3' 3' 5' 引物1 引物1 3' 引物1 引物1互补链 5'
新引 物
3'
5' 引物2 (c) 引物2互补链 3'
(d)
3' 5'
72 60 60 ℃退火 1min) (1min)
72 ℃延伸 1.5min) (1.5min)
时间(min) 时间(min)
PCR反应的温度循环周期 PCR反应的温度循环周期 如此周而复始,重复进行, 如此周而复始,重复进行,直至扩增产物的 数量满足实验需求为止. 数量满足实验需求为止.
①模板DNA(单链) 模板 (单链) ②引物 聚合酶( ③DNA聚合酶(Taq) 聚合酶 ) ④dNTP ⑤Mg2+
硫酸二甲酯(G): *ACTTCG *ACTTCGACAG
甲酸(G+A): *A *ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA *ACTTCGACAG
从下往上读:CTACGTA,末端G不能读出.
RNA的测序 (三)RNA的测序
王镜岩《生物化学》第三版考研笔记(提要版本071页)
王镜岩《生物化学》第三版考研笔记（提要版本071页）内容提要：1、氨基酸与蛋白质氨基酸分类：常见蛋白质氨基酸，不常见蛋白质氨基酸，非蛋白氨基酸；氨基酸的酸碱化学，氨基酸两性解离，氨基酸的等电点；氨基酸的旋光性和紫外吸收。
蛋白质的共价结构：蛋白质的化学组成和分类，蛋白质功能，蛋白质的形状和大小，蛋白质构象和组织层次。
肽：肽键结构，肽的物理化学性质，活性多肽。
蛋白质一级结构测定：Sanger试剂，DNS及Edman降解，二硫桥位置确定。
蛋白质的三维结构：XRD原理；稳定蛋白质三维结构的作用力，肽平面和两面角；蛋白质的二级结构：α-螺旋，β-折叠片，β-转角；超二级结构和结构域；球状蛋白的三级结构；亚基缔合和四级结构。
蛋白质结构与功能的关系：肌红蛋白和血红蛋白的结构与功能，镰刀状细胞贫血病；免疫球蛋白。
蛋白质的分离、纯化和表征：蛋白质分子量测定，沉降分析及沉降系数，沉降系数单位，凝胶过滤及SDS-PAGE法测分子量；蛋白质的沉淀；电泳：区带电泳、薄膜电泳、等电聚焦电泳、毛细管电泳。
2、酶和辅酶酶催化作用特点：反应温合、高效、专一、可调节控制；酶活性调节控制：调剂酶浓度、激素调节、反馈抑制调节、抑制剂激活剂调节、别构调控、酶原激活，可逆共价修饰；酶的化学本质及其组成，辅酶和辅基，单体酶，寡聚酶和多酶复合体。
酶的命名和分类：习惯命名法；国际系统命名法及酶的编号，六大类酶的特征。
酶的专一性：“锁与钥匙”学说；诱导楔合假说；过渡态理论，过渡态类似物与医药和农药的设计，催化抗体。
酶的活力测定：酶活力单位，比活力。
酶工程：化学修饰酶，固定化酶，人工模拟酶。
酶促反应动力学：底物浓度与酶反应速度，酶促反应动力学方程式及推导，米氏常数的意义和求法。
酶的抑制作用：不可逆抑制和可逆抑制及动力学判断，一些重要的抑制剂，有机磷农药和磺胺药作用机制。
温度、PH、激活剂对酶反应影响。
酶的作用机制：酶活性部位及研究方法；影响酶催化效率的有关因素：临近和定向效应、底物形变和诱导契合、酸碱催化、共价催化、金属离子催化、多元催化和协同效应、微环境影响；溶菌酶作用机制和胰凝乳蛋白酶。
《生物化学》 核酸的研究方法
3.紫外吸收法
常用OD260/OD280的比值来判定核酸样品的纯度。 对于纯样品: 1个OD260值相当于50ug/ml 双螺旋 DNA，
或40ug/ml单链DNA(或RNA)， 或20ug/ml寡核苷酸。 (详见P507核酸的紫外吸收)
0.4
3
收光
吸
2
0.3
1
0.2
核苷酸总 吸收值
变性DNA
天然DNA
第四单元 核酸化学
第十二章 核酸通论 第十三章 核酸的结构 第十四章 核酸的理化性质 第十五章 核酸的研究方法 小结
第15章 核酸的研究方法
一、核酸的分离、提纯和定量测定 二、核酸的超速离心 三、核酸的凝胶电泳 四、核酸的核苷酸序列测定 五、DNA聚合酶链反应(PCR) 六、DNA的化学合成
变性温度（94oC）；退火温度（待定oC）；延伸温度（72oC） 4、检测结果
最普通的方法是进行凝胶电泳，用溴化乙锭染色，紫外光下检测结
果。 PCR
PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
PCR 循环 – 第一步 – 加热变性
靶序列
靶序列
PCR 循环- 第二步 – 引物与靶序列退火
如待测DNA片段：5'-32P-GCTACGTA-3'在 特 异切断后，可得如下带有32P的各种片段。 在A处切断：32P-GCT 32P-GCTACGT 在G处切断：32P-GCTAC 在C处切断：32P-G 32P-GCTA 在T处切断：32P-GC 32P-GCTACG
进行凝胶电泳，最短的片段跑在最前面 经过放射自显影可得：
一种可能是dNTP掺入新生链，使链继续延伸。 一种可能是2 ' ，3 ' -ddNTP掺入，使新生链的合
生物化学教程(上)复习题(王镜岩--朱圣庚-徐长发-版-高等教育出版社)
二十种基本氨基酸简写符号丙氨酸Ala 精氨酸Arg 天冬氨酸Asp 半胱氨酸Cys 谷氨酰胺Gln 谷氨酸Glu 组氨酸His 异亮氨酸 Ile 甘氨酸 Gly 天冬酰胺 Asn 亮氨酸 Leu 赖氨酸 Lys 甲硫氨酸 Met 苯丙氨酸Phe 脯氨酸Pro 丝氨酸Ser 苏氨酸Thr 色氨酸Trp 酪氨酸Tyr 缬氨酸Val1.等电点：在某一特定pH值溶液时，氨基酸主要以两性离子形式存在，净电荷为零，在电场中不向电场的正极或负极移动，这时的溶液pH值称为该氨基酸的等电点。
2.杂多糖：水解时产生一种以上的单糖或和单糖衍生物，例如果胶物质、半纤维素、肽聚糖和糖胺聚糖等3.复合糖：糖类的还原端和蛋白质或脂质结合的产物。
4.蛋白多糖：又称黏多糖，为基质的主要成分，是多糖分子与蛋白质结合而成的复合。
5.糖蛋白：糖蛋白是一类复合糖或一类缀合蛋白质,糖链作为缀合蛋白质的辅基，一般少于是15个单糖单位，也称寡糖链或聚糖链。
6.糖胺聚糖：曾称粘多糖，氨基多糖和酸性多糖。
糖胺聚糖是一类由重复的二糖单位构成的杂多糖，其通式为：【己糖醛酸-己糖胺】n，n随种类而异，一般在20到60之间。
7.复合脂：除含脂肪酸和醇外，尚有所谓非脂分子成分（磷酸、糖和含氮碱等），如甘油磷脂、鞘磷脂、甘油糖脂和鞘糖脂，其中鞘磷脂和鞘糖脂又合称为鞘脂。
8.必需脂肪酸：体内不能合成或合成速度不能满足机体需要，必须通过食物供给。
9.脂蛋白：是由脂质和蛋白质以非共价键结合的复合体。
10.活化能：指在一定温度下，1mol底物全部进入活化态所需要的自由能11.过渡态：在酶催化反应中，酶与底物或底物类似物间瞬时生成的复合物，是具有高自由能的不稳定状态。
12.全酶：(1)由蛋白质组分(即酶蛋白)和非蛋白质组分(一般为辅酶或激活物)组成的一种结合酶。
(2)含有表达全部酶活性和调节活性所需的所有亚基的一种全寡聚酶。
13.反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。
《生物化学》核酸的物理化学性质
的寡聚核苷酸，细菌中发现的这类酶，主要是降解外源的 DNA ，具有很严格的碱基序列专一性。如 EcoRⅠ，不需要ATP，只需要镁离子，专一性很 强，能识别DNA上6对碱基组成的序列，交错切割，
9.8
N
N
H
NH
N
NH
H
O O
HN
NH+
pK1' 3.2
N
HN
H
H2N
N
NH
H2N
N
NH
N
N
N-
pK
' 2
9.6
H
鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上
O
O
N-
NH+
pK3' 12.4
N-
N
H2N
N
H
NH
H2N
N
N-
3、核苷酸的解离：
由于核苷酸含有碱基和磷酸基，为两性电解质，在 不同的pH溶液中解离程度不同，在一定条件下可以形成 兼性离子。核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离， 核酸的酸碱性质与此有关。
质(如核酸、蛋白质、细胞结构等)的性质或物理状态的一类标记 分子。
探针技术是在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和
诊断的非常有用的技术，已在遗传性疾病诊断上开始应用。
例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病人白细胞中提取 DNA，这就是诊断探针。用诊断探针检查，不但可以对有症状患者进行确诊，还 可以发现一些没有症状的隐性遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量DNA 后，再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。
第15章 核酸的物理化学性质和研究方法
ρ=0.1 xG-C + 1.658 xG-C =（ρ-1.658）× 10
（三）研究核酸的构象
RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大
（四）用于核酸的制备
超螺旋DNA或
三、核酸的凝胶电泳
（一）琼脂糖凝胶电泳
用于大片段DNA的分离，精度低，但 分离范围广。
• Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的 特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的 目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白 质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电 泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原 位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸 泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。 然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与 一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗 （通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白 抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化 物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果， 从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、 表达量及分子量等情况。
尿素（PAGE中DNA ）
4、变性后理化性质变化
OD260增高 比旋度下降 酸碱滴定曲线改变
粘度下降 浮力密度升高 生物活性丧失
RNA变性：从螺旋到线团之间的转变 RNA的变性引起的性质变化没有DNA明显
完全变性后核酸紫外吸收值增加： • 天然DNA 25－40%、RNA 约1.1% • 实质：碱基暴露
2、变性的实质
某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变
王镜岩生化核酸
第一节 核酸的化学组成
核 酸 核苷酸
磷酸
戊糖
核苷 碱基
P330 表5-1 两类核酸的基本化学组成
RNA： D-核糖， A、G、C、U碱基 DNA： D-2-脱氧核糖， A、G、C、T碱基
一、 碱基 1. 嘌呤碱： 2. 嘧啶碱：
P331 结构式
腺嘌呤 A 鸟嘌呤 G 胞嘧啶 C 尿嘧啶 U 胸腺嘧啶 T
第二节 DNA的结构
一级：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。 二级：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的 双螺旋结构。
三级：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。
一、 DNA的一级结构
dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3’、5’-磷酸二 酯键连接起来的线形多聚体。
P483 图 13-2 写法：5’→3’：5’-pApCpTpG-3’，或 5’…ACTG…3’
2、 含量计算
1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL核苷酸 3、 增色效应与减色效应 P347 图5-15 DNA的紫外吸收光谱
增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大 减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。
3、 拓扑异构酶
改变DNA拓扑异构体的L值。 ①拓扑异构酶酶I（拧紧） 能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每 一次作用可使L值增加1，同时，使松驰环状DNA 转变成正超螺旋。 ②拓扑异构酶酶II（拧松） 能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催 化使L减少2，同时能使正超螺旋转变成松驰DNA。
P332结构式：5’-AMP
3’-dCMP
1、 构成DNA、RNA的核苷酸 P481表134 DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMP RNA： AMP、 GMP、 CMP、 UMP 2、 细胞内游离核苷酸及其衍生物
济南大学自命题科目考试大纲338生物化学
338生物化学一、参考书目《生物化学》第三版，王镜岩，高等教育出版社二、考试题型与分值1．单项选择题：每小题1分，共30分2．填空题：每空1分，共20分3．是非题：每小题1分，共10分4．名词解释题：每小题4分，共20分5．简答题：每小题8分，共40分6．论述与实验题：每小题15分，共30分。
三、考试内容绪论1．熟练掌握什么是生物化学；了解生物化学的发展；掌握生物化学的研究方法第一章糖第一节旋光异构（了解）第二节单糖的结构（熟练掌握）第三节单糖的性质（了解）第四节重要的单糖和单糖衍生物（了解）第五节寡糖与多糖（掌握）第二章脂类第一节脂肪酸1．脂肪酸的种类（掌握）2．天然脂肪酸的结构特点（了解）第二节三酰甘油和蜡（了解）第三节磷脂1．甘油磷脂的结构（掌握）2．常见的甘油磷脂（掌握）第三章氨基酸第一节氨基酸——蛋白质的构件分子1．了解蛋白质的水解；熟练掌握α-氨基酸的一级结构第二节氨基酸的分类1．熟练掌握常见的蛋白质氨基酸不常见的蛋白质氨基酸；了解非蛋白质氨基酸第三节氨基酸的酸碱化学1．熟练掌握氨基酸的解离和氨基酸的等电点；了解氨基酸的甲醛滴定第四节氨基酸的化学反应1．掌握α-氨基、α-羧基、α-氨基和α-羧基共同参加的反应第五节氨基酸的光学活性和光谱性质1．了解氨基酸的光学活性和立体化学；掌握氨基酸的光谱性质第六节氨基酸混合物的分析分离1．熟练掌握分配层析的原理及操作方法；掌握离子交换层析的原理及操作；了解高效液相色谱简介；能够运用所学的知识解决实验问题第四章蛋白质的共价结构第一节蛋白质通论1．掌握蛋白质的化学组成和分类；了解蛋白质分子的形状和大小；熟练掌握蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次；了解蛋白质功能的多样性第二节肽1．熟练掌握肽和肽键的结构；了解肽的物理和化学性质；掌握天然存在的活性肽第三节蛋白质一级结构的测定1．了解蛋白质测序的策略及蛋白质测序的具体步骤第四节蛋白质的氨基酸序列与生物功能1．掌握同源蛋白质的物种差异与生物进化（以细胞色素C为例）；了解血液凝固与氨基酸序列的局部断裂第五节肽和蛋白质的人工合成1．了解肽的人工合成；了解胰岛素的人工合成第五章蛋白质的三维结构第一节研究蛋白质构象的方法1．了解X射线衍射法第二节稳定蛋白质三维结构的作用力1．熟练掌握稳定蛋白质三维结构的作用力：氢键、范德华力、疏水作用、盐键、二硫键第三节多肽主链折叠的空间限制1．掌握酰胺平面与α-碳原子的二面角；了解拉氏构象图第四节二级结构——多肽链折叠的规则方式1．熟练掌握蛋白质的二级结构α-螺旋、β-折叠片、β-转角和β-凸起、无规卷曲第五节纤维状蛋白质1．了解α-角蛋白、丝心蛋白和其他β-角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白第六节超二级结构和结构域1．掌握超二级结构和结构域的定义和分类第七节球形蛋白质与三级结构1．了解球形蛋白质的分类；了解球形蛋白质三维结构的特征第八节蛋白质折叠和结构预测1．熟练掌握蛋白质的变性；了解蛋白质结构的预测方法第九节亚基缔合和四级结构1．熟练掌握四级结构的概念；了解四级缔合的驱动力及亚基相互作用的方式第六章蛋白质结构与功能的关系第一节肌红蛋白的结构与功能1．熟练掌握肌红蛋白的三级结构；熟练掌握O2与肌红蛋白的结合及O2的结合改变肌红蛋白的构象；熟练掌握肌红蛋白结合氧的定量曲线第二节血红蛋白的结构与功能1．了解血红蛋白的结构2．熟练掌握氧结合引起的血红蛋白构象变化3．熟练掌握血红蛋白的协同性氧结合第三节血红蛋白分子病1．了解分子病的定义和举例；熟练掌握镰刀状细胞贫血病的发病机理及症状第四节免疫系统和免疫球蛋白1．了解免疫系统简介第五节肌球蛋白丝、肌动蛋白丝与肌肉收缩（了解）第六节蛋白质的结构与功能的进化（了解）第七章蛋白质的分离纯化和表征第一节蛋白质的酸碱性质（了解）第二节蛋白质分子的大小与形状1．熟练掌握蛋白质的相对分子质量的测定方法，并能运用所学知识解决实验问题第三节蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（了解）第四节蛋白质分离纯化的原则与方法1．了解蛋白质分离纯化的原则；掌握蛋白质分离纯化的常用方法，并能运用所学知识解决实验问题第五节蛋白质的含量测定与纯度测定1．了解蛋白质含量和纯度测定方法，并能运用所学知识解决实验问题第八章酶通论第一节酶催化作用的特点1．熟练掌握酶和一般催化剂的比较；掌握酶作为生物催化剂的特点第二节酶的化学本质及其组成（掌握）第三节酶的命名和分类（掌握）第四节酶的专一性（掌握）第五节酶的活力测定和分离纯化1．熟练酶的活力测定方法，并能运用所学知识进行计算2．熟练掌握酶的分离纯化方法，并能运用所学知识解决实验问题第六节核酶1．熟练掌握核酶的定义；掌握核酶的种类；了解核酶的研究意义和应用前景第九章酶促反应动力学第一节化学动力学基础1．了解反应速率及其测定2．了解反应分子数和反应级数及各级反应的特征第二节底物浓度对酶反应速率的影响1．掌握中间络合物学说2．熟练掌握酶促反应的动力学方程式3．了解多底物的酶促反应动力学第三节酶的抑制作用1．了解抑制程度的表示方法2．熟练掌握抑制作用的类型3．了解可逆抑制和不可逆抑制的鉴别4．了解可逆抑制作用动力学5．了解一些重要的抑制剂第四节温度对酶反应的影响（掌握）第五节pH对酶反应的影响（掌握）第六节激活剂对酶反应的影响（了解）第十章酶的作用机制和酶的调节第一节酶的活性部位1．熟练掌握酶活性部位的特点2．了解研究酶活性部位的方法第二节酶催化反应的独特性质（了解）第三节影响酶催化效率的有关因素（了解）1．底物和酶的邻近效应和定向效应2．底物的形变和诱导契合3．酸碱催化4．共价催化5．金属离子催化6．多元催化和协同效应7．活性部位微环境的影响第四节酶催化反应机制的实例（了解）第五节酶活性的调节控制1．掌握别构调控的定义和举例2．掌握酶原的激活3．了解可逆的共价修饰第六节同工酶（了解）第十一章维生素与辅酶第一节维生素概论1．掌握维生素的概念；掌握维生素的分类与辅酶的关系；掌握常见维生素的生物学功能与缺乏症第十二章核酸通论第一节核酸的发现和研究简史（了解）第二节核酸的种类和分布（熟练掌握）1．脱氧核糖核酸（DNA）2．核糖核酸（RNA）第三节核酸的生物功能（熟练掌握）1．DNA是主要的遗传物质2．RNA参与蛋白质的生物合成3．RNA功能的多样性第十三章核酸的结构第一节核酸的共价结构（熟练掌握）1．核酸中核苷酸的连接方式2．DNA的一级结构3．RNA的一级结构第二节DNA的高级结构（熟练掌握）1．DNA碱基组成的Chargaff规则2．DNA的二级结构3．DNA的三级结构4．DNA与蛋白质复合物的结构第三节RNA的高级结构（熟练掌握）1．tRNA的高级结构2．rRNA的高级结构3．其他RNA的高级结构第十四章核酸的物理化学性质第一节核酸的水解（掌握）1．酸水解2．碱水解3．酶水解第二节核酸的酸碱性质（了解）第三节核酸的紫外吸收（掌握）第四节核酸的变性、复性及杂交（掌握）第十五章核酸的研究方法第一节核酸的分离、提纯和定量测定（掌握）第二节核酸的超速离心（了解）第三节核酸的凝胶电泳（掌握）第四节核酸的核苷酸序列测定（掌握）第五节聚合酶链式反应（熟练掌握）第六节DNA的化学合成（了解）第十六章新陈代谢总论一、分解代谢与合成代谢（掌握）二、新陈代谢的调节（了解）三、新城代谢中的高能化合物（掌握）第十七章生物能学一、热力学基本概念（了解）二、自由能的变化和意义（掌握）第十八章氧化磷酸化作用一、氧化还原电势（了解）二、电子传递和氧化呼吸链（熟练掌握）三、氧化磷酸化作用（熟练掌握）第二十章糖酵解作用一、糖酵解作用的研究历史（了解）二、糖酵解过程概述（熟练掌握）三、糖酵解与生醇发酵过程图解（熟练掌握）四、糖酵解反应机制（熟练掌握）五、糖酵解作用的能量计算与调控机制（熟练掌握）六、其它六碳糖进入糖酵解途径（了解）第二十一章柠檬酸循环一、柠檬酸循环途径（熟练掌握）二、柠檬酸循环的化学结算（熟练掌握）三、柠檬酸循环的调控（熟练掌握）四、柠檬酸循环的双重作用（掌握）五、柠檬酸循环的发现历史（了解）第二十二章戊糖磷酸途径一、戊糖磷酸途径的发现（了解）二、戊糖磷酸途径的主要反应（掌握）三、戊糖磷酸途径的调控及生物学意义（掌握）第二十三章糖异生和糖的其它代谢途径一、熟练掌握糖异生作用的定义、反应过程及生物学意义二、葡萄糖的转运（了解）三、乙醛酸途径（掌握）第二十四章糖原的分解和生物合成一、糖原的生物学意义（了解）二、糖原的降解（掌握）三、糖原的生物学合成（掌握）第二十五章脂质的代谢一、三酰甘油的消化、吸收和转运（了解）二、脂肪酸的氧化（熟练掌握）三、不饱和脂肪酸的氧化（掌握）四、酮体（熟练掌握）五、脂肪酸代谢的调节（了解）六、脂质的生物合成（掌握）第二十六章蛋白质降解和氨基酸的分解一、蛋白质的降解（了解）二、氨基酸分解代谢（掌握）三、尿素的形成（熟练掌握）四、氨基酸碳骨架的氧化途径（了解）五、生糖氨基酸和生酮氨基酸（掌握）六、由氨基酸衍生的其它重要物质（掌握）七、氨基酸代谢缺陷症（了解）第二十七章氨基酸的生物合成一、氨的同化作用（了解）二、氨基酸的生物合成（了解）三、氨基酸生物合成的调节（了解）四、氨基酸转化为其他氨基酸及其他代谢物（了解）第二十八章核酸的降解和核苷酸代谢一、核酸和核苷酸的分解代谢（熟练掌握）二、核苷酸的生物合成（了解）三、辅酶核苷酸的生物合成（了解）第二十九章新陈代谢的调节控制一、细胞代谢调节控制的基本原理（了解）二、酶活性和酶量的调节（掌握）三、细胞对代谢途径的分隔与控制（了解）四、代谢紊乱疾病（了解）第三十章基因和染色体一、基因和基因组的结构（了解）二、染色体的结构（掌握）第三十一章DNA的复制和修复一、DNA的复制（熟练掌握）二、DNA的损伤修复（掌握）三、DNA的突变（掌握）第三十二章RNA的生物合成和加工一、DNA指导下的RNA合成（熟练掌握）二、RNA的转录后加工（熟练）三、RNA指导下RNA和DNA的合成（了解）第三十三章蛋白质合成、加工和定位一、遗传密码（熟练掌握二、蛋白质合成有关RNA和装置（熟练掌握三、蛋白质合成的步骤（熟练掌握）四、蛋白质合成的忠实性（了解）五、蛋白质的定位（了解第三十四章基因表达调节一、基因表达调节的基本原理（掌握）二、原核生物基因表达调节（掌握）三、真核生物基因表达调节（了解）。
第15章核酸的物理化学性质和研究方法
沉降系数(S)增加 沉降系数 增加
（二）核酸的复性 1、变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的 过程。将热变性的DNA骤然降温， DNA骤然降温 过程。将热变性的DNA骤然降温，不能复性形成无规则线 如缓慢降温，可以复性，叫退火。 团，如缓慢降温，可以复性，叫退火。 2、影响复性速度的因素： 、影响复性速度的因素： 浓度越高,复性越快 （1）单链片段浓度 浓度越高 复性越快 ）单链片段浓度,浓度越高 片段越大,扩散慢 （2）单链片段的大小 片段越大 扩散慢，错配频率高，复 ）单链片段的大小,片段越大 扩散慢，错配频率高， 性越慢 片段内重复序列的多,复性快 （3）片段内重复序列的多少 片段内重复序列的多 复性快 ）片段内重复序列的多少,片段内重复序列的多 （4）溶液一定的离子强度 能消除磷酸基负电荷造成的斥 ）溶液一定的离子强度,能消除磷酸基负电荷造成的斥 可加快复性速度. 力,可加快复性速度 可加快复性速度 在一定条件下复性的速度可用Cot1/2来衡量，Co为完全变 来衡量， 为完全变 在一定条件下复性的速度可用 来衡量 性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示， 为时间 为时间(s)， 性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示，t为时间 ， Cot1/2表示复性一半的 表示复性一半的Cot值 表示复性一半的 值
90
70
75
80 T /℃
85
2、影响Tm的因素 、影响 的因素
的相对含量高Tm高 已知 已知Tm,依据经验公式求 （1）G-C的相对含量高 高,已知 ） 的相对含量高 依据经验公式求 G-C的含量或 值：（G+C）% =（Tm — 69.3）× 2.44 的含量或Tm值 G+C） =（ 69.3） 的含量或 较低。 （2）溶液离子强度低的介质中，Tm较低。 ）溶液离子强度低的介质中， 较低 变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键， （3）变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱 基堆积， Tm下降 下降。 基堆积，使Tm下降。 高时,溶液中的 可取代T的 与 （4）溶液的 ： pH高时 溶液中的 ）溶液的pH： 高时 溶液中的OH可取代 的O与A 可取代 形成化学键.所以 大于11.3时DNA完全变性；pH低时 溶 形成化学键 所以pH大于 时 完全变性； 低时,溶 所以 大于 完全变性 低时 液中的H+可取代 可取代A的 与 形成化学键 所以低于5.0时 形成化学键.所以低于 液中的 可取代 的H与T形成化学键 所以低于 时 DNA易脱嘌呤 易脱嘌呤. 易脱嘌呤 （5）均质 ）均质DNA（polyA-T）或（polyG-C)熔链温度发生 （ ） 熔链温度发生 在一个较小的范围内，异质DNA熔链温度发生在一个较 在一个较小的范围内，异质 熔链温度发生在一个较 宽的范围内。 宽的范围内。
生物化学第14章核酸的物理化学性质和第15章核酸的研究方法
核酸中磷酸基的解离
核苷酸的解离曲线Ⅰ
核苷酸的解离曲线Ⅱ
尿苷酸的碱 基的碱性极 弱 ， 实际上 测不出其含 氮环的解离 曲线 ， 故不 能形成兼性 离子。 离子。
从中间往 两边滴为 曲线Ⅰ， 非缓冲区 较宽。 较宽。
小 滴 定 曲 线 的 腺
DNA
牛 胸
从两边往 中间滴为 曲线Ⅱ， 非缓冲区 较窄。 较窄。
式中A为测得的吸光度 ， 为磷的浓度 为磷的浓度， 为比 式中 为测得的吸光度， c为磷的浓度 ， L为比 为测得的吸光度 色杯的厚度， 为每升溶液中磷的重量 为每升溶液中磷的重量（ 色杯的厚度，W为每升溶液中磷的重量（克）。
DNA的增色效应和减色效应
一 般 天 然 DNA 的 ε(P) 为 ～ 6600 ， RNA 为 7700～ 7800。 单链核酸的 ～ 比双链核酸的大， 。 单链核酸的ε(P)比双链核酸的大 ， 比双链核酸的大 核苷酸单体的ε(P)更大 。 双链 更大。 双链DNA变性成单链 核苷酸单体的 更大 变性成单链 值增大， 后ε(P)值增大，称为增色效应；复性后 值增大 称为增色效应；复性后ε(P)值减 值减 称为减色效应。 小 ， 称为减色效应 。 这是因为双链结构使碱基 对的π电子云发生重叠，减少了对紫外光的吸收。 对的 电子云发生重叠，减少了对紫外光的吸收。 电子云发生重叠
GC对含量与熔点的关系
RNA的热变性曲线
RNA只有局部的双螺旋，所以其Tm较低，变 只有局部的双螺旋，所以其 较低， 只有局部的双螺旋 较低 性温度范围较宽。不管是DNA还是 还是RNA，加入甲 性温度范围较宽。不管是 还是 ， 酰胺可降低其Tm值。双链 值 双链RNA的变性曲线几乎与 酰胺可降低其 的变性曲线几乎与 双链DNA相同。 相同。 双链 相同
第15章 核酸的物理化学性质和研究方法
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
降解：核苷酸骨架上 ， 磷酸二酯键的断裂 降解：核苷酸骨架上3’，5 ’-磷酸二酯键的断裂
1. 引起核酸变性的因素
（1）温度；加热到80～100℃ 80～ 温度；加热到80 （2）酸碱度改变 （3）化学试剂：尿素 、甲醛 化学试剂：
核苷酸的解离
由于核苷酸含有磷酸与碱基 为两性电介质， 由于核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电介质，它 磷酸与碱基， 们在不同pH的溶液中解离程度不同， pH的溶液中解离程度不同 们在不同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件 兼性离子。 下可形成兼性离子 下可形成兼性离子。 核苷酸解离时， 核苷酸解离时，带负电荷的第一磷酸基正好与带 正电荷的含氮环数目相等时的pH即为此核苷酸的 pH即为此 正电荷的含氮环数目相等时的pH即为此核苷酸的 等电点 DNA： DNA：约为 4.0 ~ 4.5 RNA： RNA：约为 2.0 ~ 2.5
第15章 15章 核酸物理化学性质和研究方法
NH2 N
N
N H
N
核酸的一般理化性质
• 核酸为多元酸，具有较强的酸性； 核酸为多元酸，具有较强的酸性； 酸性 • 微溶于水，不溶于有机溶剂 微溶于水， • DNA是线性高分子，粘度极大； DNA是线性高分子，粘度极大； 是线性高分子 • 在260nm波长有最大吸收峰，是由碱基的 260nm波长有最大吸收峰，是由碱基的 波长有最大吸收峰 共轭双键决定的 决定的。 共轭双键决定的。这一特性常用作核酸的 定性、定量分析。 定性、定量分析。
增色效应： 增色效应：核酸发生变性 时，摩尔磷消光系数增加 的现象。 的现象。 减色效应：复性后，摩尔 减色效应：复性后， 磷消光系数又降低的效应。 磷消光系数又降低的效应。
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5'-CTGCA G-3,
5'-CTGCA
G-3,
3'-G ACGTC-5，
3'-G +
ACGTC-5，
(b) EcoRI切割位点,切割后形成5`-P的单链粘性末端，
5'-G AATTC-3’ 3'-CTTAA G-5’
5'-G + 3'-CTTAA
AATTC-3’ G-5’
（c）EcoRV切割位点,切割后形成平末端。
第三节 核酸的紫外吸收
• 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、 核苷酸和核酸在240—290nm的紫外波段有一 强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不 同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外 分光光度计加以定量及定性测定。
1. 核酸样品纯度和含量的鉴定
• 从A260／A280的比值即可判断样品的纯 度。
2. 核酸变性的特点
• （1）一系列物化性质也随之发生改变 ： 紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密 度升高，酸碱滴定曲线改变等
• （2） 变性作用发生在一个很窄的温度范 围内 。
• 通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失 去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔 解温度，用Tm表示。DNA的Tm值一般 在82—95℃之间
2. Cot l/2 • 衡量复性反应的速度快慢的指标 • Co为变性DNA复性时的初始浓度，以核
苷酸的摩尔浓度表示， • t为时间，以秒表示， • Cot l/2表示复性一半的Cot值
•在DNA浓度相同的情况下， Cot l/2与基因组的大小成正比
三、核酸的杂交 (hybridization)
不同构象的核酸（线形、环 形、超螺旋），密度和沉降速 率不同，用密度梯度离心可以 将不同构象DNA、RNA与蛋 白质区分开来
（一）核酸密度的测定
8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 ρ=ρ0 +4.2ω2（r2 - r02） × 10-10
5'-GAT ATC-3’
3'-CTA TAG-5’
5'-GAT
3`-CTA
+ ATC-3’
TAG-5`
核酸内切限制酶的命名法
• （1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母， 组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例 如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流 感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。
• 由于核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电介 质，它们在不同pH的溶液中解离程度不同， 在一定条件下可形成兼性离子。带负电荷 的磷酸基正好与带正电荷的含氮环数目相 等，这时的pH即为此核苷酸的等电点
•
pI = (pk1’+pK2’)/2
• ppKK12’’值是是由由于于含第氮一环磷＝酸N+基H--的P0解3H离2的，解离，
（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或 型，例如Ecok。
（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此， 流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别 表示为HindI、HindII、HindIII等等。
第二节 核酸的酸碱性质
1．碱基的解离
• 核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解 离，核酸的酸碱性质与此有关。
（1）. Southern印迹杂交
• 将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并 结合在适当的滤膜上，然后通过与标记 的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测 这些被转移的DNA片段
• 由于它是由E．Southern于1975年首先设 计出来的，故叫做Southern DNA印迹转 移技术。
（2）Northern blotting
c. 因此，断裂形成的DNA片段具有互补的单 链延伸末端。
a. 识别位点：
• 能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的 核苷酸序列；
• 切割位点的一个共同特点是，它们具有 双重旋转对称的结构形式，换言之，这 些核苷酸对的顺序是呈回文结构。
（a）Pst I切割位点 , 切割后形成3`-OH的单链粘性末端，
1979 年 ， 发 展 出 了 一 种 新 的 方 法 ， 将 RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素 滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进 行核酸杂交的一种实验方法。由此可见 ，这种方法同DNA印迹杂交技术十分类 似
（3）Western blotting
• 将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝 酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标 记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种 技术叫做Western蛋白质杂交技术。
• 纯DNA的A 260／A280应大于1.8， • 纯RNA的A 260／A280应达到2.0
• 对于纯的样品，只要读出260nm的A值即 可算出含量。通常以1A=50ug／mL双螺 旋DNA或40ug／mL单链DNA(或RNA)， 或20ug／mL寡核苷酸计算
• 对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳 分离出区带后，经溴化乙锭染色在紫外
核酸限制内 3 种 不 同 的 单一的成份 切酶的蛋白 亚基 质结构
2种不同的 亚基
切割位点
在距特异性位 点 至 少 1000bp 的地方可能随 机地切割
Hale Waihona Puke 位于特异性位 点或其附近距特异性位点3， 端24~26bp处
甲 基 化 作 用 的 特异性的位点 位点
特 异 性 的 位 点 ； 特异性的位点 一般为A或C
(3) 限制性内切酶
限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原 核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科 全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一 项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出 了2300种以上。
第15章 核酸的研究方法
一、核酸的分离、提纯和定量测定
制备天然核酸必需采用温和的条件， 防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其 重要的是防止核酸酶的作用
（一）DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP 溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不 溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl
二、复性 (renaturation)
• 变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开 的链重新缔合成为双螺旋结构，这过程称复性
• 1. DNA复性的特点： • （1）许多物化性质又得到恢复 • （2）将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可
能复性 • （3）DNA的片段越大，复性越慢。 • （4）DNA的浓度越大，复性越快。
磷酸三酯
H2O
三、酶水解
• 专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶 （nuclease) ；水解核酸的酶种类很多
• 1．核酸酶的分类 • (1) 按底物专一性分 • 核糖核酸酶(RNase)：作用于RNA • 脱氧核糖核酸酶(DNase)：作用于DNA。 • (2)按对底物作用的方式 • 核酸内切酶(endonuclease) • 核酸外切酶(exonuclease) • 既可内切，也能外切 的核酸酶
识别未甲基化 能
能
能
的序列进行核
酸内切酶切割
序 列 特 异 的 切 不是
是
是
割
DNA 克 隆 中 的 无用 用处
十分有用
用处不大
Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
它具有三个基本特性：
a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位， 切割DNA分子产生链的断裂；
b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通 常不是彼此直接相对的；
• 复性后ε(P)值又降低，这现象称减色效应。 • 测定核酸的ε(P)可判断DNA制剂是否发生变性
或降解。
第四节 核酸的变性、复性及杂交
一、核酸的变性(denaturation)
• 变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链， 并不涉及共价键的断裂。
1. 引起核酸变性的因素
• （1）温度；加热到80～100℃ • （2）酸碱度改变 • （3）化学试剂：尿素 、甲醛
灯下粗略地估计其含量。
有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷吸光系 数来表示： ε(P)=A/c l
• 一般天然DNA的ε(P)为6 600，RNA为7 700—7 800。单链多核苷酸的ε(P)值比双螺旋结构多 核苷酸的ε(P)值要高。
• 核酸发生变性时，ε(P)值升高，此现象称为 增色效应。（这是因为双螺旋结构使碱基对的 π电子云发生重叠，因而减少了对紫外光的吸 收）
3．脱氧核糖核酸酶类
• (1)牛胰脱氧核糖核酸酶（DNasel) ：此 内切酶切断双链DNA或单链DNA成为以 5’-磷酸为末端的寡聚核苷酸。需镁离子 (或Mn2+，Co2+)，最适pH 7-8。
•
• (2)牛脾脱氧核糖核酸酶（DNaseⅡ) ：此 酶降解DNA成为3’-磷酸末端的寡聚核 苷酸。最适pH 4～5，需0.3 mol／L钠离 子激活，镁离子可以抑制此酶。
第14章 核酸的物理化学性质
第一节 核酸的水解
核酸的水解
核酸
水
核苷酸
解
磷酸
核苷
戊糖
碱基
一、酸水解
• 水解特点：
• 1.糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解 • 2.但糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解 • 3.嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸
更不稳定
二、碱水解
• 水解特点： • 1. RNA的磷酸酯键易被碱水解；而DNA对碱稳定
• 1. 定义： • 将不同来源的DNA放在试管里，经热变
性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异 源DNA之间在某些区域有相同的序列， 则复性时，会形成杂交DNA分子。 • DNA与互补的RNA之间也可以发生杂交。 是分子生物学和分子遗传学的研究中应 用极广的技术。