王镜岩-生物化学I-第14章 核酸的物理化学性质—第15章 核酸的研究方法
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c. 因此，断裂形成的DNA片段具有互补的单 链延伸末端。
a. 识别位点：
• 能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的 核苷酸序列；
• 切割位点的一个共同特点是，它们具有 双重旋转对称的结构形式，换言之，这 些核苷酸对的顺序是呈回文结构。
（a）Pst I切割位点 , 切割后形成3`-OH的单链粘性末端，
不同构象的核酸（线形、环 形、超螺旋），密度和沉降速 率不同，用密度梯度离心可以 将不同构象DNA、RNA与蛋 白质区分开来
（一）核酸密度的测定
8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 ρ=ρ0 +4.2ω2（r2 - r02） × 10-10
（三）核酸含量的测定
1、紫外吸收法 1个A～50μg/ml 双链DNA ～40μg/ml RNA或单链DNA
2、定糖法 RNwenku.baidu.com：核糖→ 糠醛→ →绿色物质（670-680nm）
浓HCl 苔黑酚/地衣酚
DNA：脱氧核糖+二苯胺→兰色物质（595-620nm）
浓硫酸
3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸
• 纯DNA的A 260／A280应大于1.8， • 纯RNA的A 260／A280应达到2.0
• 对于纯的样品，只要读出260nm的A值即 可算出含量。通常以1A=50ug／mL双螺 旋DNA或40ug／mL单链DNA(或RNA)， 或20ug／mL寡核苷酸计算
• 对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳 分离出区带后，经溴化乙锭染色在紫外
（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或 型，例如Ecok。
（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此， 流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别 表示为HindI、HindII、HindIII等等。
第二节 核酸的酸碱性质
1．碱基的解离
• 核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解 离，核酸的酸碱性质与此有关。
5'-GAT ATC-3’
3'-CTA TAG-5’
5'-GAT
3`-CTA
+ ATC-3’
TAG-5`
核酸内切限制酶的命名法
• （1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母， 组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例 如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流 感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。
由于嘧啶和嘌 呤化合物杂环 中的氮以及各 取代基具有结 合和释放质子 的能力，所以 这些物质既有 碱性解离又有 酸性解离的性 质。
例如：胞嘧啶的解离
胞嘧啶环所含氮原子上有一对未共用电子，可与质子结合 ； 此外，胞嘧啶上的烯醇式羟基与酚基很相像，具有释放质 子的能力，呈酸性
例如：腺嘌呤的解离
2. 核苷酸的解离
识别未甲基化 能
能
能
的序列进行核
酸内切酶切割
序 列 特 异 的 切 不是
是
是
割
DNA 克 隆 中 的 无用 用处
十分有用
用处不大
Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
它具有三个基本特性：
a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位， 切割DNA分子产生链的断裂；
b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通 常不是彼此直接相对的；
• 在上世纪中 期，以 Arber等人 对入噬菌体 在大肠杆菌 不同菌株上 的平板培养 效应的研究 为基础，发 现了原核生 物体内存在 着寄生控制 的限制和修 饰系统。
核酸内切限制酶的类型
特性
I型
II型
III型
限制和修饰 单一多功能 分开的核酸 具有一种共
活性
的酶
内切酶和甲 同亚基的双
基化酶
功能的酶
第三节 核酸的紫外吸收
• 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、 核苷酸和核酸在240—290nm的紫外波段有一 强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不 同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外 分光光度计加以定量及定性测定。
1. 核酸样品纯度和含量的鉴定
• 从A260／A280的比值即可判断样品的纯 度。
（1）. Southern印迹杂交
• 将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并 结合在适当的滤膜上，然后通过与标记 的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测 这些被转移的DNA片段
• 由于它是由E．Southern于1975年首先设 计出来的，故叫做Southern DNA印迹转 移技术。
（2）Northern blotting
第14章 核酸的物理化学性质
第一节 核酸的水解
核酸的水解
核酸
水
核苷酸
解
磷酸
核苷
戊糖
碱基
一、酸水解
• 水解特点：
• 1.糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解 • 2.但糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解 • 3.嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸
更不稳定
二、碱水解
• 水解特点： • 1. RNA的磷酸酯键易被碱水解；而DNA对碱稳定
• 1. 定义： • 将不同来源的DNA放在试管里，经热变
性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异 源DNA之间在某些区域有相同的序列， 则复性时，会形成杂交DNA分子。 • DNA与互补的RNA之间也可以发生杂交。 是分子生物学和分子遗传学的研究中应 用极广的技术。
2. 常见杂交的类型
• （1）Southern blotting • （2）Northern blotting • （3）Western blotting
3．脱氧核糖核酸酶类
• (1)牛胰脱氧核糖核酸酶（DNasel) ：此 内切酶切断双链DNA或单链DNA成为以 5’-磷酸为末端的寡聚核苷酸。需镁离子 (或Mn2+，Co2+)，最适pH 7-8。
•
• (2)牛脾脱氧核糖核酸酶（DNaseⅡ) ：此 酶降解DNA成为3’-磷酸末端的寡聚核 苷酸。最适pH 4～5，需0.3 mol／L钠离 子激活，镁离子可以抑制此酶。
4、琼脂糖凝胶电泳
溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物
在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比
（四）、核酸纯度的测定
OD260／OD280
纯DNA 比值1.8，＜ 1.8 Pr、苯酚污染 纯RNA 比值2.0， < 2.0 DNA、 Pr、苯酚污
染
二、核酸的沉降特性与超速离心
3. 影响Tm值的因素
• (1) DNA的 均一性 。越 均一，DNA 熔解温度发 生在一个很 窄的温度范 围之内
• (2) G-C之 含量 。G-C 对含量越多， Tm值越高
• (3) 介质中的离子强度 。一般说在较高的 离子强度时，DNA的Tm值较高，而且熔 解过程发生在一个较小的温度范围之内。
二、复性 (renaturation)
• 变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开 的链重新缔合成为双螺旋结构，这过程称复性
• 1. DNA复性的特点： • （1）许多物化性质又得到恢复 • （2）将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可
能复性 • （3）DNA的片段越大，复性越慢。 • （4）DNA的浓度越大，复性越快。
磷酸三酯
H2O
三、酶水解
• 专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶 （nuclease) ；水解核酸的酶种类很多
• 1．核酸酶的分类 • (1) 按底物专一性分 • 核糖核酸酶(RNase)：作用于RNA • 脱氧核糖核酸酶(DNase)：作用于DNA。 • (2)按对底物作用的方式 • 核酸内切酶(endonuclease) • 核酸外切酶(exonuclease) • 既可内切，也能外切 的核酸酶
2. 核酸变性的特点
• （1）一系列物化性质也随之发生改变 ： 紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密 度升高，酸碱滴定曲线改变等
• （2） 变性作用发生在一个很窄的温度范 围内 。
• 通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失 去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔 解温度，用Tm表示。DNA的Tm值一般 在82—95℃之间
去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。
DNA沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇
（二）RNA的分离
制备RNA时，最重要的是使RNase灭活：
①所有容器都要经过高温处理，不能高温高压 的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。
②加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活；
③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂 （如RNasin)
灯下粗略地估计其含量。
有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷吸光系 数来表示： ε(P)=A/c l
• 一般天然DNA的ε(P)为6 600，RNA为7 700—7 800。单链多核苷酸的ε(P)值比双螺旋结构多 核苷酸的ε(P)值要高。
• 核酸发生变性时，ε(P)值升高，此现象称为 增色效应。（这是因为双螺旋结构使碱基对的 π电子云发生重叠，因而减少了对紫外光的吸 收）
• 复性后ε(P)值又降低，这现象称减色效应。 • 测定核酸的ε(P)可判断DNA制剂是否发生变性
或降解。
第四节 核酸的变性、复性及杂交
一、核酸的变性(denaturation)
• 变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链， 并不涉及共价键的断裂。
1. 引起核酸变性的因素
• （1）温度；加热到80～100℃ • （2）酸碱度改变 • （3）化学试剂：尿素 、甲醛
第15章 核酸的研究方法
一、核酸的分离、提纯和定量测定
制备天然核酸必需采用温和的条件， 防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其 重要的是防止核酸酶的作用
（一）DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP 溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不 溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl
1979 年 ， 发 展 出 了 一 种 新 的 方 法 ， 将 RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素 滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进 行核酸杂交的一种实验方法。由此可见 ，这种方法同DNA印迹杂交技术十分类 似
（3）Western blotting
• 将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝 酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标 记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种 技术叫做Western蛋白质杂交技术。
核酸限制内 3 种 不 同 的 单一的成份 切酶的蛋白 亚基 质结构
2种不同的 亚基
切割位点
在距特异性位 点 至 少 1000bp 的地方可能随 机地切割
位于特异性位 点或其附近
距特异性位点3， 端24~26bp处
甲 基 化 作 用 的 特异性的位点 位点
特 异 性 的 位 点 ； 特异性的位点 一般为A或C
(3) 限制性内切酶
限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原 核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科 全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一 项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出 了2300种以上。
• 由于核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电介 质，它们在不同pH的溶液中解离程度不同， 在一定条件下可形成兼性离子。带负电荷 的磷酸基正好与带正电荷的含氮环数目相 等，这时的pH即为此核苷酸的等电点
•
pI = (pk1’+pK2’)/2
• ppKK12’’值是是由由于于含第氮一环磷＝酸N+基H--的P0解3H离2的，解离，
5'-CTGCA G-3,
5'-CTGCA
G-3,
3'-G ACGTC-5，
3'-G +
ACGTC-5，
(b) EcoRI切割位点,切割后形成5`-P的单链粘性末端，
5'-G AATTC-3’ 3'-CTTAA G-5’
5'-G + 3'-CTTAA
AATTC-3’ G-5’
（c）EcoRV切割位点,切割后形成平末端。
• (3) 按磷酸二酯键断裂的方式 • 在3’-OH与磷酸基之间断裂 • 在5’-OH与磷酸基之间断裂
2．核糖核酸酶类
• (1)牛胰核糖核酸酶；简称RNaseI或 RNaseA ； 只作用于RNA，不作用于DNA。十分耐热。 具有极高专一性的内切酶，其作用点为：嘧啶 核苷-3’-磷酸与其他核苷酸之间的连键，产 物为3’-P-嘧啶核苷酸
2. Cot l/2 • 衡量复性反应的速度快慢的指标 • Co为变性DNA复性时的初始浓度，以核
苷酸的摩尔浓度表示， • t为时间，以秒表示， • Cot l/2表示复性一半的Cot值
•在DNA浓度相同的情况下， Cot l/2与基因组的大小成正比
三、核酸的杂交 (hybridization)
a. 识别位点：
• 能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的 核苷酸序列；
• 切割位点的一个共同特点是，它们具有 双重旋转对称的结构形式，换言之，这 些核苷酸对的顺序是呈回文结构。
（a）Pst I切割位点 , 切割后形成3`-OH的单链粘性末端，
不同构象的核酸（线形、环 形、超螺旋），密度和沉降速 率不同，用密度梯度离心可以 将不同构象DNA、RNA与蛋 白质区分开来
（一）核酸密度的测定
8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 ρ=ρ0 +4.2ω2（r2 - r02） × 10-10
（三）核酸含量的测定
1、紫外吸收法 1个A～50μg/ml 双链DNA ～40μg/ml RNA或单链DNA
2、定糖法 RNwenku.baidu.com：核糖→ 糠醛→ →绿色物质（670-680nm）
浓HCl 苔黑酚/地衣酚
DNA：脱氧核糖+二苯胺→兰色物质（595-620nm）
浓硫酸
3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸
• 纯DNA的A 260／A280应大于1.8， • 纯RNA的A 260／A280应达到2.0
• 对于纯的样品，只要读出260nm的A值即 可算出含量。通常以1A=50ug／mL双螺 旋DNA或40ug／mL单链DNA(或RNA)， 或20ug／mL寡核苷酸计算
• 对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳 分离出区带后，经溴化乙锭染色在紫外
（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或 型，例如Ecok。
（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此， 流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别 表示为HindI、HindII、HindIII等等。
第二节 核酸的酸碱性质
1．碱基的解离
• 核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解 离，核酸的酸碱性质与此有关。
5'-GAT ATC-3’
3'-CTA TAG-5’
5'-GAT
3`-CTA
+ ATC-3’
TAG-5`
核酸内切限制酶的命名法
• （1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母， 组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例 如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流 感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。
由于嘧啶和嘌 呤化合物杂环 中的氮以及各 取代基具有结 合和释放质子 的能力，所以 这些物质既有 碱性解离又有 酸性解离的性 质。
例如：胞嘧啶的解离
胞嘧啶环所含氮原子上有一对未共用电子，可与质子结合 ； 此外，胞嘧啶上的烯醇式羟基与酚基很相像，具有释放质 子的能力，呈酸性
例如：腺嘌呤的解离
2. 核苷酸的解离
识别未甲基化 能
能
能
的序列进行核
酸内切酶切割
序 列 特 异 的 切 不是
是
是
割
DNA 克 隆 中 的 无用 用处
十分有用
用处不大
Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
它具有三个基本特性：
a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位， 切割DNA分子产生链的断裂；
b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通 常不是彼此直接相对的；
• 在上世纪中 期，以 Arber等人 对入噬菌体 在大肠杆菌 不同菌株上 的平板培养 效应的研究 为基础，发 现了原核生 物体内存在 着寄生控制 的限制和修 饰系统。
核酸内切限制酶的类型
特性
I型
II型
III型
限制和修饰 单一多功能 分开的核酸 具有一种共
活性
的酶
内切酶和甲 同亚基的双
基化酶
功能的酶
第三节 核酸的紫外吸收
• 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、 核苷酸和核酸在240—290nm的紫外波段有一 强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不 同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外 分光光度计加以定量及定性测定。
1. 核酸样品纯度和含量的鉴定
• 从A260／A280的比值即可判断样品的纯 度。
（1）. Southern印迹杂交
• 将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并 结合在适当的滤膜上，然后通过与标记 的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测 这些被转移的DNA片段
• 由于它是由E．Southern于1975年首先设 计出来的，故叫做Southern DNA印迹转 移技术。
（2）Northern blotting
第14章 核酸的物理化学性质
第一节 核酸的水解
核酸的水解
核酸
水
核苷酸
解
磷酸
核苷
戊糖
碱基
一、酸水解
• 水解特点：
• 1.糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解 • 2.但糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解 • 3.嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸
更不稳定
二、碱水解
• 水解特点： • 1. RNA的磷酸酯键易被碱水解；而DNA对碱稳定
• 1. 定义： • 将不同来源的DNA放在试管里，经热变
性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异 源DNA之间在某些区域有相同的序列， 则复性时，会形成杂交DNA分子。 • DNA与互补的RNA之间也可以发生杂交。 是分子生物学和分子遗传学的研究中应 用极广的技术。
2. 常见杂交的类型
• （1）Southern blotting • （2）Northern blotting • （3）Western blotting
3．脱氧核糖核酸酶类
• (1)牛胰脱氧核糖核酸酶（DNasel) ：此 内切酶切断双链DNA或单链DNA成为以 5’-磷酸为末端的寡聚核苷酸。需镁离子 (或Mn2+，Co2+)，最适pH 7-8。
•
• (2)牛脾脱氧核糖核酸酶（DNaseⅡ) ：此 酶降解DNA成为3’-磷酸末端的寡聚核 苷酸。最适pH 4～5，需0.3 mol／L钠离 子激活，镁离子可以抑制此酶。
4、琼脂糖凝胶电泳
溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物
在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比
（四）、核酸纯度的测定
OD260／OD280
纯DNA 比值1.8，＜ 1.8 Pr、苯酚污染 纯RNA 比值2.0， < 2.0 DNA、 Pr、苯酚污
染
二、核酸的沉降特性与超速离心
3. 影响Tm值的因素
• (1) DNA的 均一性 。越 均一，DNA 熔解温度发 生在一个很 窄的温度范 围之内
• (2) G-C之 含量 。G-C 对含量越多， Tm值越高
• (3) 介质中的离子强度 。一般说在较高的 离子强度时，DNA的Tm值较高，而且熔 解过程发生在一个较小的温度范围之内。
二、复性 (renaturation)
• 变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开 的链重新缔合成为双螺旋结构，这过程称复性
• 1. DNA复性的特点： • （1）许多物化性质又得到恢复 • （2）将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可
能复性 • （3）DNA的片段越大，复性越慢。 • （4）DNA的浓度越大，复性越快。
磷酸三酯
H2O
三、酶水解
• 专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶 （nuclease) ；水解核酸的酶种类很多
• 1．核酸酶的分类 • (1) 按底物专一性分 • 核糖核酸酶(RNase)：作用于RNA • 脱氧核糖核酸酶(DNase)：作用于DNA。 • (2)按对底物作用的方式 • 核酸内切酶(endonuclease) • 核酸外切酶(exonuclease) • 既可内切，也能外切 的核酸酶
2. 核酸变性的特点
• （1）一系列物化性质也随之发生改变 ： 紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密 度升高，酸碱滴定曲线改变等
• （2） 变性作用发生在一个很窄的温度范 围内 。
• 通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失 去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔 解温度，用Tm表示。DNA的Tm值一般 在82—95℃之间
去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。
DNA沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇
（二）RNA的分离
制备RNA时，最重要的是使RNase灭活：
①所有容器都要经过高温处理，不能高温高压 的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。
②加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活；
③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂 （如RNasin)
灯下粗略地估计其含量。
有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷吸光系 数来表示： ε(P)=A/c l
• 一般天然DNA的ε(P)为6 600，RNA为7 700—7 800。单链多核苷酸的ε(P)值比双螺旋结构多 核苷酸的ε(P)值要高。
• 核酸发生变性时，ε(P)值升高，此现象称为 增色效应。（这是因为双螺旋结构使碱基对的 π电子云发生重叠，因而减少了对紫外光的吸 收）
• 复性后ε(P)值又降低，这现象称减色效应。 • 测定核酸的ε(P)可判断DNA制剂是否发生变性
或降解。
第四节 核酸的变性、复性及杂交
一、核酸的变性(denaturation)
• 变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链， 并不涉及共价键的断裂。
1. 引起核酸变性的因素
• （1）温度；加热到80～100℃ • （2）酸碱度改变 • （3）化学试剂：尿素 、甲醛
第15章 核酸的研究方法
一、核酸的分离、提纯和定量测定
制备天然核酸必需采用温和的条件， 防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其 重要的是防止核酸酶的作用
（一）DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP 溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不 溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl
1979 年 ， 发 展 出 了 一 种 新 的 方 法 ， 将 RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素 滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进 行核酸杂交的一种实验方法。由此可见 ，这种方法同DNA印迹杂交技术十分类 似
（3）Western blotting
• 将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝 酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标 记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种 技术叫做Western蛋白质杂交技术。
核酸限制内 3 种 不 同 的 单一的成份 切酶的蛋白 亚基 质结构
2种不同的 亚基
切割位点
在距特异性位 点 至 少 1000bp 的地方可能随 机地切割
位于特异性位 点或其附近
距特异性位点3， 端24~26bp处
甲 基 化 作 用 的 特异性的位点 位点
特 异 性 的 位 点 ； 特异性的位点 一般为A或C
(3) 限制性内切酶
限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原 核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科 全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一 项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出 了2300种以上。
• 由于核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电介 质，它们在不同pH的溶液中解离程度不同， 在一定条件下可形成兼性离子。带负电荷 的磷酸基正好与带正电荷的含氮环数目相 等，这时的pH即为此核苷酸的等电点
•
pI = (pk1’+pK2’)/2
• ppKK12’’值是是由由于于含第氮一环磷＝酸N+基H--的P0解3H离2的，解离，
5'-CTGCA G-3,
5'-CTGCA
G-3,
3'-G ACGTC-5，
3'-G +
ACGTC-5，
(b) EcoRI切割位点,切割后形成5`-P的单链粘性末端，
5'-G AATTC-3’ 3'-CTTAA G-5’
5'-G + 3'-CTTAA
AATTC-3’ G-5’
（c）EcoRV切割位点,切割后形成平末端。
• (3) 按磷酸二酯键断裂的方式 • 在3’-OH与磷酸基之间断裂 • 在5’-OH与磷酸基之间断裂
2．核糖核酸酶类
• (1)牛胰核糖核酸酶；简称RNaseI或 RNaseA ； 只作用于RNA，不作用于DNA。十分耐热。 具有极高专一性的内切酶，其作用点为：嘧啶 核苷-3’-磷酸与其他核苷酸之间的连键，产 物为3’-P-嘧啶核苷酸
2. Cot l/2 • 衡量复性反应的速度快慢的指标 • Co为变性DNA复性时的初始浓度，以核
苷酸的摩尔浓度表示， • t为时间，以秒表示， • Cot l/2表示复性一半的Cot值
•在DNA浓度相同的情况下， Cot l/2与基因组的大小成正比
三、核酸的杂交 (hybridization)