分子生物学研究法(下)
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1）同源重组
2）非同源重组
2 DNA与蛋白质相互作用研究
2.1 凝胶阻滞试验（gel retardation assay）
凝胶阻滞试验，又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay, EMSA ），是用于体外研究DNA与蛋 白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中， 由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量 的对数成反比。若此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么， 由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在 特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质结合，于是在凝胶 电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带
2.2 DNaseI足迹试验（DNA foot-printing assay）
将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制性内 切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链单个末端标记的 双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后， 再加入少量的DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化 DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA单链只发生 一次磷酸二酯键断裂。
当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在 凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与 提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。
*
*
放射性标记的DNA
*
凝胶电泳Hale Waihona Puke Baidu
* B* * ** *
B
A
C
细胞蛋白质提取物
* 蛋白质与DNA结合
DNA-蛋白质结合物 电泳迁移缓慢
放射自显影
滞后带表明DNA与蛋 白质结合
若蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白 质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端 1个、2个、3个核苷酸等一系列长度仅相差一个核苷 酸的连续的DNA片段梯度群体。若有一种蛋白质已经 结合到DNA分子的某一特定区段上，那么，它将保护 这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不 能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自 显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标 记条带的空白区域，人们形象地称之为“足迹”。
PCR等方法向目的DNA片段中引入点突变，使已克隆基因或 DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失等。 定点突变能迅速和高效地改变DNA所表达的目的蛋白的性状， 是基因工程和蛋白质工程的重要研究手段。
基 因 的 体 外 改 造
（2）体内改造
➢ 基因敲除：是一种基因打靶技术。主要是 应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替 代靶基因片段；也可通过插入突变,使靶基因 失活。
2）第二种质粒载体pGAD424，又叫做文库质粒载体或AD
质粒载体，它具有亮氨酸基因(leu)，是用来构建cDNA表
达文库的专用载体 。
把所有cDNA都 克隆到pGAD424载 体上，构成cDNA表 达文库。
形成第二种杂种蛋白质(Y)。这种与AD融合的蛋白质叫做基 因文库编码蛋白质，其中可与诱饵蛋白质发生相互作用的特称
b. 转录激活域(Transcriptional activation domain, AD)，它通过与转录机器(transcription machinery)中其它成分的结合作用，以启动UAS下 游基因进行转录。
➢ 酵母半乳糖苷酶基因的转录因子-GAL4
研究发现，真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的。
在酵母GAL4的N端1-147位氨基酸区有一个DNA结合域(DNABD)；在GAL4的C端768-881位氨基酸区有一个转录激活域(AD)。 一般情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段
（UAS）相结合，AD则推动了转录起始。
按照所用转录因子的异同，可将酵母双杂交体系分 为LexA和GAL4两个类型，在此以GAL4类型为例。
若将BD和AD这两个结构域的编码区分别克隆到两个载体 中,再把它们转入同一寄主细胞中进行表达，由此产生的GAL4 DNA-BD和GAL4 AD多肽，由于彼此之间不直接发生相互作用， 所以不能激活其相关的效应基因进行转录。
若将上述分开的两种结构域在体内重新组装成具有功能 活性的转录因子，则能激活下游报告基因进行表达。
酵母双杂交体系在细胞周期调节、信号传导、 肿瘤基因表达等诸多的研究领域，都有着广泛的应 用。
➢ 转录因子的两个主要结构域
a. DNA结合域(DNA binding domain, BD)，它可识别 效应基因上游的一段特定的区段，即上游激活序列 (up-stream activating sequence, UAS)，并与之 结合。
➢ 酵母双杂交体系的构建过程
（1）构建两种E.coli-Yeast穿梭质粒载体
1）第一种质粒载体pGBT9，这种质粒载体又叫做诱饵质粒
载体或DNA-BD质粒载体(具trp基因) 。
把已知的 靶蛋白质编码 基因克隆到 pGBT9的多克隆 位点上。
通常将此种与BD融合的蛋白质叫做诱饵蛋白质(Bait protein)
第六章
分子生物学研究方法(下)
本章主要内容
基因表达研究技术 蛋白质组学及研究技术
1 基因改造技术
（1）体外改造
1）缺失：DNA→限制酶酶切→外切酶Bal 31酶切
→连接酶。 2）点突变：DNA→变性→与突变的引物杂交→聚
合反应，连接反应。
➢ 定点突变（site-directed mutagenesis） 是指通过
1
(a) 32p *
1
(b) *
(c)
5
10
加入蛋白质X
4
8
10
加入DNaseI 凝胶电泳放
射自显影
10
足迹
5
1
AB
DNaseI 足迹实验
3 酵母双杂交系统(yeast-two hybrid system)
酵母双杂交体系也叫interaction trap（相互
作用陷井），是上世纪90年代初期发展起来的一种 敏感的检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，也是体 内鉴定基因的方法。可有效地用来分离能与一种已 知的靶蛋白(target protein)相互作用的另一种蛋 白质及其编码基因，而且还可以用来确定蛋白质相 互作用的特异性结构域及其氨基酸序列。
2）非同源重组
2 DNA与蛋白质相互作用研究
2.1 凝胶阻滞试验（gel retardation assay）
凝胶阻滞试验，又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay, EMSA ），是用于体外研究DNA与蛋 白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中， 由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量 的对数成反比。若此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么， 由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在 特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质结合，于是在凝胶 电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带
2.2 DNaseI足迹试验（DNA foot-printing assay）
将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制性内 切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链单个末端标记的 双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后， 再加入少量的DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化 DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA单链只发生 一次磷酸二酯键断裂。
当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在 凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与 提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。
*
*
放射性标记的DNA
*
凝胶电泳Hale Waihona Puke Baidu
* B* * ** *
B
A
C
细胞蛋白质提取物
* 蛋白质与DNA结合
DNA-蛋白质结合物 电泳迁移缓慢
放射自显影
滞后带表明DNA与蛋 白质结合
若蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白 质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端 1个、2个、3个核苷酸等一系列长度仅相差一个核苷 酸的连续的DNA片段梯度群体。若有一种蛋白质已经 结合到DNA分子的某一特定区段上，那么，它将保护 这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不 能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自 显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标 记条带的空白区域，人们形象地称之为“足迹”。
PCR等方法向目的DNA片段中引入点突变，使已克隆基因或 DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失等。 定点突变能迅速和高效地改变DNA所表达的目的蛋白的性状， 是基因工程和蛋白质工程的重要研究手段。
基 因 的 体 外 改 造
（2）体内改造
➢ 基因敲除：是一种基因打靶技术。主要是 应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替 代靶基因片段；也可通过插入突变,使靶基因 失活。
2）第二种质粒载体pGAD424，又叫做文库质粒载体或AD
质粒载体，它具有亮氨酸基因(leu)，是用来构建cDNA表
达文库的专用载体 。
把所有cDNA都 克隆到pGAD424载 体上，构成cDNA表 达文库。
形成第二种杂种蛋白质(Y)。这种与AD融合的蛋白质叫做基 因文库编码蛋白质，其中可与诱饵蛋白质发生相互作用的特称
b. 转录激活域(Transcriptional activation domain, AD)，它通过与转录机器(transcription machinery)中其它成分的结合作用，以启动UAS下 游基因进行转录。
➢ 酵母半乳糖苷酶基因的转录因子-GAL4
研究发现，真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的。
在酵母GAL4的N端1-147位氨基酸区有一个DNA结合域(DNABD)；在GAL4的C端768-881位氨基酸区有一个转录激活域(AD)。 一般情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段
（UAS）相结合，AD则推动了转录起始。
按照所用转录因子的异同，可将酵母双杂交体系分 为LexA和GAL4两个类型，在此以GAL4类型为例。
若将BD和AD这两个结构域的编码区分别克隆到两个载体 中,再把它们转入同一寄主细胞中进行表达，由此产生的GAL4 DNA-BD和GAL4 AD多肽，由于彼此之间不直接发生相互作用， 所以不能激活其相关的效应基因进行转录。
若将上述分开的两种结构域在体内重新组装成具有功能 活性的转录因子，则能激活下游报告基因进行表达。
酵母双杂交体系在细胞周期调节、信号传导、 肿瘤基因表达等诸多的研究领域，都有着广泛的应 用。
➢ 转录因子的两个主要结构域
a. DNA结合域(DNA binding domain, BD)，它可识别 效应基因上游的一段特定的区段，即上游激活序列 (up-stream activating sequence, UAS)，并与之 结合。
➢ 酵母双杂交体系的构建过程
（1）构建两种E.coli-Yeast穿梭质粒载体
1）第一种质粒载体pGBT9，这种质粒载体又叫做诱饵质粒
载体或DNA-BD质粒载体(具trp基因) 。
把已知的 靶蛋白质编码 基因克隆到 pGBT9的多克隆 位点上。
通常将此种与BD融合的蛋白质叫做诱饵蛋白质(Bait protein)
第六章
分子生物学研究方法(下)
本章主要内容
基因表达研究技术 蛋白质组学及研究技术
1 基因改造技术
（1）体外改造
1）缺失：DNA→限制酶酶切→外切酶Bal 31酶切
→连接酶。 2）点突变：DNA→变性→与突变的引物杂交→聚
合反应，连接反应。
➢ 定点突变（site-directed mutagenesis） 是指通过
1
(a) 32p *
1
(b) *
(c)
5
10
加入蛋白质X
4
8
10
加入DNaseI 凝胶电泳放
射自显影
10
足迹
5
1
AB
DNaseI 足迹实验
3 酵母双杂交系统(yeast-two hybrid system)
酵母双杂交体系也叫interaction trap（相互
作用陷井），是上世纪90年代初期发展起来的一种 敏感的检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，也是体 内鉴定基因的方法。可有效地用来分离能与一种已 知的靶蛋白(target protein)相互作用的另一种蛋 白质及其编码基因，而且还可以用来确定蛋白质相 互作用的特异性结构域及其氨基酸序列。