环氧化酶2(COX-2)基因功能多态性与中国人群乳腺癌危险性关系的研究

环氧化酶2(COX-2)基因功能多态性与中国人群乳腺

癌危险性关系的研究1

高君1，柯巧1，马红霞1，王艳1，胡志斌1，翟祥军1，王雪晨2，秦建伟3，陈文森1，靳光付1，刘继勇1，王心如1，魏庆义4，沈洪兵1

1南京医科大学流行病与卫生统计学系，南京（210029）

2南京市鼓楼医院外科，南京（210008）

3江苏省肿瘤医院乳腺外科，南京（210009）

4 M. D. Anderson肿瘤中心流行病系，休斯顿（77030）

E-mail：hbshen@

摘要：环氧化酶（Cyclooxygenase）是前列腺素（Prostaglandins，PGs）合成的限速酶，至少有两种同工酶, 即COX-1和COX-2。在肿瘤发生中起着重要作用，COX-2过度表达能够促进细胞增殖、抑制凋亡和促进乳腺癌细胞侵袭。COX-2功能性多态改变可能改变个体对乳腺癌的易感性。本研究中对COX-2的三个多态位点(启动子区的-1195G/A、-765G/C和in 3’UTR区的8473C/T)与中国人群乳腺癌遗传易感性的关系进行了研究。我们的病例对照研究中包括615例病理学明确诊断的乳腺癌病例和643例无癌对照，以年龄进行频数匹配。Logistic回归分析显示， COX-2三个多态性位点单位点分析未发现与乳腺癌危险性的关联。但是，以携带0-3个突变等位基因者为参照，我们发现携带3个以上突变等位基因的个体患乳腺癌的风险显著增加（调整OR =1.36，95%CI=1.01-1.83）。单倍型分析发现与常见的单倍型G-1195G-765T8473相比单倍型A-1195G-765T8473和A-1195C-765T8473可以显著提高个体患乳腺癌的风险（OR值及95%可信区间分别为1.20（1.01-1.43）和9.16（1.14–73.51））。研究结果提示提示COX-2基因调控区域的这三个单核苷酸多态可能参与乳腺癌的病理进程。

关键词：环氧化酶2（COX-2），基因多态性，乳腺癌，分子流行病学

中图分类号：R18

1．引言

环氧化酶（Cyclooxygenase ，COX）也叫做前列腺素内过氧化物合酶（prostaglandin endoperoxide synthases ，PTGs），是花生四烯酸代谢过程中前列腺素合成的限速酶。前列腺素（Prostaglandins，PGs）在多种生理和病理进程中发挥了重要作用，包括：炎症、细胞增殖和血管生成等，这些在肿瘤的发生发展中也起了关键性作用[1-3]。COX至少有两种同工酶, 即COX-1和COX-2。COX-1是结构型酶，体内大多数影响PG合成的正常组织都可表达。而COX-2是诱导型酶，在大多数正常组织中都不表达，但在生长因子、细胞因子、内毒素、激素、促肿瘤剂及癌基因等多种刺激因素的作用下可迅速诱导其表达[4-6]。COX-2过度表达能够促进细胞增殖、抑制凋亡和促进新生血管生成[2,7-8]。近年来研究发现，COX-2在多种肿瘤中呈过度表达[9-13]，包括乳腺癌[14-16]。Denkert等[17]报道COX-2过度表达与乳腺癌的淋巴结转移、低分化程度、肿瘤大小有关。另外，众多研究包括流行病学研究[18-20]和动物实验[21,22]证明了定期服用非甾体类抗炎药（NSAIDs）能够预防乳腺癌的发生，其主要机制通过抑制COX-2的作用。

转录水平上的调控是COX-2基因调控表达和稳定性的主要机制[23]。Mestre等[24,25]报道COX-2基因的启动子区包含了多种转录因子结合位点，例如：CRE（cAMP应答启动子元件）以及Sp1、NF-κB、c-MYB等因子结合位点。因此， COX-2基因启动子区的多态性改变可能潜在地影响某种因子的结合，改变基因的转录活性，进而影响环氧化酶的表达[26-28]及肿瘤的

1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（20040312006）的资助。

发生。张雪梅等[28]发现，在COX-2基因启动子区-1195G→A的多态性改变产生了一个c-MYB

转录因子结合位点，增强了COX-2基因的转录活性。并且在中国人群的病例对照研究中证实

了-1195G/A和启动子区的另一个单核苷酸多态-765G/C与食管癌的遗传易感性密切相关。有

研究[26.27]认为启动子区的-765G/C是一个潜在的功能性位点，G→C的突变消除了一个Sp1结

合位点，但是产生了一个E2F结合位点，进而导致环氧化酶2表达的增加或减少。另外，有

研究表明鼠类COX-2基因的33’端非编码区含有一些调控序列，可以改变mRNA的稳定性以

及翻译效率[29]，因此这对于mRNA的降解、稳定和翻译很重要[30]。所以，COX-2基因的3’

端非编码区的多态改变可能会改变调控因子的亲和力而影响COX-2的表达，进而影响个体对

癌症（包括乳腺癌）的易感性[31-33]。

在本研究中，我们假设COX-2基因的启动子区两个多态(-1195G/A、-765G/C)和3’端非编

码区的单核苷酸多态(8473C/T)可能单独或/和联合与乳腺癌的遗传易感性有关。为了验证这

个假设，我们通过病例对照研究（615例乳腺癌病例和643例频率匹配的无癌对照），对COX-2

-1195G/A、-765G/C和8473C/T三个多态性与中国人群乳腺癌遗传易感性的关系进行研究。2．材料和方法

2.1 研究对象

研究包括615例乳腺癌病例和643例频率匹配的无癌对照。病例为2004年1月至2005年3

月在江苏省人民医院、江苏省肿瘤医院、南京市鼓楼医院、东南大学附属中大医院收治的新

发乳腺癌患者。所有患者都为无亲缘关系的南京市及其周边地区汉族人群，经病理组织学确诊。剔除标准包括既往癌症史，其他组织转移癌症和有既往放⁄化疗史。对照是从江苏省社

区慢性非传染性疾病筛查的人群（共10,500个对象）中随机挑选的，根据病例的城乡（城市

或农村）和年龄（±5岁）分布进行频数匹配，为无乳腺肿瘤和其它肿瘤患病史的健康女性。

研究对象签署知情同意书后，由经过统一培训的调查员使用统一的调查表，对全部调查对象

进行面访问卷调查，内容包括一般情况、月经及生育史、与生殖相关的生活方式、环境暴露

史和一级亲属肿瘤家族史（父母、同胞和孩子）。调查后，每位研究对象提供5ml的静脉血液

标本。

2.2 基因型检测

染色体DNA是从外周血白细胞中提取的,按照蛋白酶K消化然后酚－氯仿提取和乙醇沉

淀的标准程序。参照文献[28,34]设计COX-2 -1195G/A、-765G/C 和8473C/T的扩增引物，序列

如下: −1195G/A F, 5′-ccctgagcactacccatgat-3′, R, 5′-gcccttcataggagatactgg-3′; −765G/C F, 5′-tattatgaggagaatttacctttcgc-3′, R, 5′-gctaagttgctttcaacagaagaaat-3′; and8473C/T F, 5′-gtttgaaattttaaagtacttttgat-3′, R, 5′-tttcaaattattgtttcattgc-3′. 20µlPCR扩增反应体系包括：约50 ngDNA、12.5 pmol引物、0.1 mM dNTP、1 × PCR buffer (50 mM KCl,10 mM Tris-HCl和0.1% Triton X-100, pH 9.0,) and 1 U Taq酶。8473C/T位点的MgCl2浓度是1.8 mM，而−1195G/A和

-765G/C的是1 mM。PCR扩增循环包括95°C预变性5min，接着进入循环；95°C变性30s；然

后按COX-2 -1195G/A、-765G/C 和8473C/T位点，分别以61°C、54°C及53°C退火40s; 接着72°C延伸45s，2-4步骤循环35次后72°C延伸10min。分别用内切酶PvuII, HhaI和BclI (New England BioLabs, Beverly, MA)来辨别−1195G/A,−765G/C和8473C/T基因型。虽然一些基因型

缺失或者由于某些DNA质量和⁄或数量问题导致分型失败，但是每个位点仍然达到了95%的

应答率。最终，本研究成功获得601例乳腺癌病例和643例对照的三个多态性位点的所有基因