终稿-微生物实验技术

2个主要环节：
诱变（随机）
选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、 分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致
死的同时，使存活个体中的突变频率大大提
高。
设计有效的筛选方法，将少量正变株中的
筛选（定向）
优良菌株挑选出来。
（一） 出发菌株（original strain）
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。
紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸 收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更 为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式 很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其 最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间 形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配 对，从而引起微生物突变或死亡。
主要是向分类学家提供准确的、可重复的 、大信息量的处理手段。
3、化学分类
是研究微生物细胞不同化学特性，并利用 这些特性对生物个体进行分类和鉴定。
由于细胞化学成分及分子结构的稳定性好 ，因此化学分类是原核微生物系统分类学的主 要方法之一。
3、化学分类的常用方法
细胞（壁）化学组分分析 枝菌酸分析（诺卡氏菌） 磷酸类脂分析 脂肪酸组分分析 醌组分分析 全细胞蛋白SDS-PAGE分析 核糖体蛋白双向凝胶电泳（2D-PAGE）
（一）标准曲线的制备： 标准曲线：
第二次实验：
（一）标准曲线的制备： 标准曲线：
第二次实验：
（二）发酵： 接种：将活化好的菌液按照2%接种量，接种至发
酵培养基中；
培养：37℃，180rpm摇床振荡培养； 取样：分别取24h、48h发酵液测定其酶活。
第三次实验：
（一）酶活测定： 参照《GB/T 23527-2009 蛋白酶制剂》
LB发酵液体培养基
蛋白胨：10.0g； 酵母膏： 5.0 g； 氯化钠：10.0g； 蒸馏水：1000ml pH到 7.0。
第二次实验：
（一）菌剂准备： 离心收集（8000rpm，5min）活化好的菌种； 倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心
洗涤。 用无菌生理盐水悬浮菌液，配制成约1.0 ×108/ml
微生物学实验技术
一株产中性蛋白酶芽孢细菌的选育
山东农业大学生命科学学院 微生物学系
2013.09
实验内容
一、产中性蛋白酶芽孢细菌的初步筛选
二、产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种
三、产中性蛋白酶芽孢细菌的发酵复筛 四、产中性蛋白酶芽孢细菌的分类鉴定 五、产酶菌株生长曲线的测定 六、产酶菌株的菌种保藏
实验二 产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种
分离延迟现象。
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
初筛
2步
复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性
Fra Baidu bibliotek
（2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；
抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；
沉淀圈法（外毒素）
透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 2. 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，直接检测所需产物
一、目的意义 二、材料方法 三、数据结果 四、讨论分析 五、参考文献
一、目的意义
1、通过菌种选育，筛选获得一株高产中 性蛋白酶的突变菌株。
二、材料方法
关键技术:
实验原理：紫外线诱变 技术路线：
紫外线诱变育种的原理
紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对 诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一 般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80% 是254 nm。
菌悬液制备 活菌计数
诱变预备实验（剂量存活率曲线） 诱变处理（相对杀菌率为70-75%，30-70%） 活菌计数
中间培养（培养过夜，克服表型延迟）
突变株分离
初筛
复筛
生产性能试验
菌种（鉴定与）保藏
第一次实验：
讨论并设计实验方案； 实验材料准备：培养基、无菌水、离心管等； 活化：LB培养基，37℃摇床振荡16-20h
分类鉴定手册的使用 分类鉴定的标准流程 标准菌株参比
二、材料方法-基本原理
（一）微生物生长曲线的测定方法
多相分类法：Colwell1970年提出，指利用微生物
多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育 的信息，综合研究微生物分类和系统进化的过程。多 相分类法几乎包括了现代分类中所有的方面，如传统 分类、化学分类、分子分类、数值分类等，被认为是 目前研究各级分类单元最有效的手段，可用于所有水 平上的分类单元的描述和定义。
一、目的意义
通过液体发酵法产生中性蛋白酶，采用 Folin-酚法测定其产酶活性，从初筛及诱 变所得的菌株中获得一株高产中性蛋白 酶的菌株。
二、材料方法
关键技术:
标准曲线的制作 液体发酵产酶 Folin-酚法测定中性蛋白酶活性
技术路线：
标准曲线的制备
出发菌株（纯化） 突变株分离
初筛（水解圈法） 复筛（发酵法）
保藏：37℃培养24h，保藏备用； 讨论下一步实验方案（发酵法复筛）并准
备实验材料；
三、数据结果
处理
10秒
20秒
30秒
对照
稀释倍数
菌落数 存活率/% 致死率/%
四、讨论分析
致死率 诱变率 评价体系 ……
五、参考文献（举例）
[1] 李红亚等，芽孢杆菌乳酸高产菌株UZ-3-15的紫外线 诱变选育，河北大学学报，Vol.31 NO.6，627-631
正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂 量中。
在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%, 甚至 30~70%的剂量。
UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来 确定剂量多少。
3. 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用；
②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用.
物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。
( NTG——超诱变剂）
UV是最常用的一种诱变剂
2. 剂量的选择
常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）
最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度， 又能使变异向正突变范围移动的剂量。
突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提 高剂量, 反而会使突变率下降。
时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须 经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到
变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。
分离性延迟的原因: 对数生长期中，单核细胞常出现双核
现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变 通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代 或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为
葡萄糖：2.5g； 蛋白胨：5.0g； 酵母膏：2.5 g； 氯化钠：2.5g； 蒸馏水：1000ml pH到 7.0。
第二次实验：
（一）标准曲线的制备： 参照《GB/T 23527-2009 蛋白酶制剂》 蛋白酶制剂：
第二次实验：
（一）标准曲线的制备： 蛋白酶活性定义：
第二次实验：
经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因 此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波 紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后 样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理 后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑 暗中修复。
诱变育种中的几个原则
指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变 率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。
1、传统分类法
也称描述分类，主要指以形态特征、培养 特征以及生理生化特征等表观分类指征，对微 生物分类单元进行的描述分类。
传统分类是认识微生物实际重要性和研究 生物进化的基础。
2、数值分类
是随着信息数字化时代的发展，根据微生 物分类学信息，应用计算数学原理和技术辅助 定义微生物分类单元的一种方法。
生产性能实验 菌种鉴定 菌种鉴定
第一次实验：
讨论并设计实验方案； 实验材料准备：活化培养基、发酵培养基
等； 活化：LB培养基，37℃摇床振荡16-24h
活化液体培养基
蛋白胨：10.0g； 酵母膏：5.0 g； 氯化钠：10.0g； 蒸馏水：1000ml pH到 7.0。
发酵液体培养基
2013.09
实验内容
一、产中性蛋白酶芽孢细菌的初步筛选 二、产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种
三、产中性蛋白酶芽孢细菌的发酵复筛
四、产中性蛋白酶芽孢细菌的分类鉴定 五、产酶菌株生长曲线的测定 六、产酶菌株的菌种保藏
实验三 产中性蛋白酶芽孢菌的发酵复筛
一、目的意义 二、材料方法 三、数据结果 四、讨论分析 五、参考文献
（四） 中间培养（CM，培养过夜）
目的：克服表型延迟
表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的 现象.
分离性延迟： 突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯 合状态，表型才能表现出来。
生理性延迟：: 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 表现出来。
生理性延迟的原因: 当变异细胞由杂合状态变为纯合状态
和照射过的菌悬液各1 ml进行适当稀释分离。 涂布：取适宜稀释度的稀释液0.1ml涂于酪蛋白平板
上。 培养： 37℃培养48h， (用黑布包好平板)。注意在
每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别等。
第三次实验：
统计：菌落计数并测量透明圈大小，从中 挑选出目标菌株。
转接：挑取生长饱满的单菌落转接入LB试 管斜面，每个分离物转接5支试管。
诱变育种的基本原则：
• 选择简便有效的诱变剂； • 挑选优良的出发菌株； • 处理单细胞或单孢子悬液； • 选用最适的诱变剂量； • 充分利用复合处理的协同效应； • 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； • 设计高效筛选方案； • 创造新型筛选方法。
技术路线：
出发菌株（纯化） 前培养（ 培养至对数期）
4、分子分类
出发菌株的选择标准： • 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、
标记明显等）； • 对诱变剂敏感
出发菌株的来源： •野生型菌株； •从生产中选育的自发突变菌株； •诱变获得的高产菌株
（二） 菌悬液的制备
1. 选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）
目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂； ②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）
五、产酶菌株生长曲线的测定
六、产酶菌株的菌种保藏
实验五 产酶菌株生长曲线的测定
一、目的意义 二、材料方法 三、数据结果 四、讨论分析 五、参考文献
一、目的意义
1、了解常见微生物生长曲线的测定方法 的原理特点及其适用范围
比浊法、干重法……
2、掌握比浊法测定细菌生长曲线的方法
二、材料方法
关键技术:
[2] 游玟娟等，紫外线诱变选育酸性α － 淀粉酶高产菌株， 安徽农学通报，2010，16( 11)
[3] 夏丽等，紫外线诱变选育高产纳豆激酶菌株的研究， 农产品加工，第4 期(总第206 期)，2010 年4 月
[4] ……
微生物学实验技术
一株产中性蛋白酶芽孢细菌的选育研究
山东农业大学生命科学学院 微生物学系
第三次实验：
（二）菌种鉴定方案讨论： （三）菌种鉴定试验准备
三、数据结果
四、讨论分析
标准曲线 Folin-酚法测酶活 ……
五、参考文献（举例）
微生物学实验技术
一株产中性蛋白酶芽孢细菌的选育
山东农业大学生命科学学院 微生物学系
2013.10
实验内容
一、产中性蛋白酶芽孢细菌的初步筛选 二、产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种 三、产中性蛋白酶芽孢细菌的发酵复筛 四、产中性蛋白酶芽孢细菌的分类鉴定
2. 同步培养（生理状态一致）
3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期
4.菌悬液的制备方法
物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制
5. 菌悬液的浓度
酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL
（三）诱变剂的选择及处理方法
1. 诱变剂的选择（高效，简便）
第二次实验：
（二）诱变处理： 预热：在正式照射前，应先开紫外线30min，让紫
外灯预热。 搅拌：取5ml制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放
入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W 紫外线下30cm处。 照射：打开皿盖边搅拌边照射，所有操作必须在黑 暗或红灯下进行。
第二次实验：
（三）培养： 稀释：在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)