_聚谷氨酸产生菌的发酵培养基优化

1- 1
1-1 -1-1 1-1 -1-1 1 1 -1 1 1 1 1 1 -1-1 1-1
1 -1 -1- 1 -1 -1 -1- 1 1- 1
1- 1 -1 -1- 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 1
根据 Box2 B ehnken 的中心组合设计原理 , 利用
m initab 软件设计三因素三水平的响应面实验 , 以豆
114 响应面实验设计 11411 Plackett2 B ur m an 设计
本实验在前期单因素实验的基础上 , 选用 N = 9 的 Plackett2 B ur m an 设计对发酵培养基中的 9 个组分 (NaCl、 豆粕 、 柠檬酸钠 、 谷氨酸钠 、 NH4 C l、 K2 HPO4 、
0. 25 0. 3 0. 35 0. 4 0. 45 0. 5 0. 55
从表 4 可看出 , 最优发酵条件在第 3 组实验附 近 ,因此以第 3 组的水平作为响应面实验的中心点 , 即豆粕 50 g /L ,M nSO4 ・H2 O 0135 g /L , NH4 Cl 5 g /L。
213 响应面分析实验
因素 编码水平
- 1 0 1
X 1 (豆粕 ) X 2 (MnSO 4 ・H 2 O ) X 3 (NH4 Cl)
1- 1 1- 1
1 -1 1 -1
-1 -1 1 -1 -1
1 -1- 1
由表 3 可看出 , 豆粕 、 谷氨酸钠 、 K2 HPO4 、 M g2
SO4 、 M nSO4 表现为正效应 , NaC l、 柠檬酸钠 、 NH4 Cl、 CaC l2 表现为负效应 。可信度大于 90%的因素为豆
K2 HPO 4 / ( g・L - 1 ) MgSO 4 ・7H2 O / ( g・L - 1 ) MnSO 4 ・H2 O / ( g・L - 1 ) CaCl2 ・2H2 O / ( g・L - 1 )
-1
11413 响应面分析实验方法
212 最陡爬坡实验
用 m initab 软件设计试验 , 采用 Box2 B ehnken 设 计法 ,对于影响 γ2 聚 谷氨酸产率的显著因素进行进 一步研究 ,从而获得菌株产 γ2 聚 谷氨酸的最佳培养 基组成 。
PGA 发酵产率 ,为工业化应用奠定基础 。
[2 - 5]
温度 37 ℃,培养时间 12 h。 摇瓶发酵 : 250 mL 三角瓶装发酵培养基 35 mL , 种子液以 3%的接种量接入发酵培养基中 , 培养温度
37 ℃,摇床转速 200 r/m in,培养时间 48 h。
γ2PGA 的测定 11312 摇瓶发酵液经 16 000 r/m in 离心 15 m in 去除菌 体 ,取上清液加入 215 倍体积的体积分数 95%乙醇 , 适当搅拌得到沉淀 ,沉淀用去离子水溶解 ,透析过夜 , 透析液加 215 倍体积 95%乙醇 , 得到的沉淀物在 60 ℃ 干燥至恒重 ,称重 。
表 2 N = 9 的 Plackett2Burman 实验设计与结果
序号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A -1 B 1 C 1 1 D -1 -1 E 1 1 F G H I γ2PG A / ( g・L - 1 ) 1 1 1 1 1 1 7170 6121 5166 7105 16170 20113 10102 6180 6183 19108 13191 12140 -1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 1 1
-1 0 1 0 0 0 -1 1 1 0 -1 0 0 -1 1
R 2 (调整 )
表 8 回归方程系数显著性检验表
模型项
X1 X2 X3 X1 X1 X2 X2 X3 X3 X1 X2 X1 X3 X2 X3
系数估计
11175 0 - 01687 5 01487 5 - 11537 5 - 11062 5 - 11562 5 - 01050 0 - 11400 0 11525 0
符号
A B C D E F G H I
因子
NaCl/ ( g・L - 1 )
水平
-1 15 32 16 32 516 015 1 0115 012 1 18 40 20 40 7 01625 1125 012 0125
表 3 各因素效应值及显著性分析
因素
A B C D E F G H I
效应
- 01728 71892 - 21698 11665 - 31242 21128 01758 31508 - 01095
食品与发酵工业
FOOD AND FERMENTATION INDUSTR IES
γ2聚谷氨酸产生菌的发酵培养基优化
李文婧 ,赵祥颖 ,田延军 ,张家祥 ,韩延雷 ,刘建军
1 (山东轻工业学院食品与生物工程学院 , 山东 济南 , 250353 ) 2 (山东省食品发酵工程重点实验室 , 山东 济南 , 250013)
粕、 M nSO4 、 NH4 C l、 柠檬酸钠 、 K2 HPO4 ,其中豆粕 、 M n2
SO4 、 NH4 C l的可信度大于 95% ,表现为极显著 。
/ ( g・L 45 50 55
-1
)
/ ( g・L 013 014
-1
)
/ ( g・L - 1 ) 4 5 6
0135
根据 Plackett2 B urman 实 验 结 果 确 定 豆 粕 、 M n2
-1- 1 -1 1- 1 -1- 1 1 1 1 1
1 -1
粕、 M nSO4 、 NH4 C l三个因素为自变量 ,以 γ2PGA 产率 为响应值 ,根据最陡爬坡实验的结果确定实验中心和 水平 ,实验因素与水平的选取见表 5, Box2 B ehnken 实 验设计见表 6。
表 5 Box2Behnken 实验因素与水平
种子培养基 ( g /L ) : 蛋白胨 10, 酵母膏 5, NaC l
第一作者 : 硕士研究生 (刘建军教授为通讯作者 ) 。 收稿日期 : 2009 - 11 - 09
108
2010 V o l1 36 N o 1 3 ( To ta l 267 )
生产与科研经验 表 1 Plackett2Burman 实验因素水平
Adj MS 51888 5 51575 8 61372 2 51717 5 01201 5 01250 0
F 29122 27167 31162 28137
P 01001 01002 01001 01001
0 1 1 - 1 - 1 0 0 - 1 0 0 1 0 1 - 1 0
-1 -1 0 1 -1 0 1 0 -1 0 0 0 1 0 1
[1]
, 具有良好的金属离子吸
附性 、 水溶性 、 吸水保湿性 、 生物相容性 、 可生物完全 降解性 、 可食用性 ,具有极大的开发价值和广阔的应 用前景 。 γ2PGA 的生产方法主要有化学合成法 、 酶转化法 和微生物发酵法 。其中发酵法生产 γ2PGA 最具竞争 力 ,已报道的 γ2PGA 生产菌主要包括枯草芽孢杆菌 、 炭疽芽孢杆菌 、 地衣芽孢杆菌 、 短小芽孢杆菌等 。目 前由于 γ2PGA 菌株生产能力低 , 缺乏发酵工艺及提 取工艺的系统研究 , 严重制约了我国 γ2PGA 的产业 化进程 。本研究拟通过响应面法对实验室保藏菌株 B acillus am y loliquefaciens L536 产 γ2PGA 发酵培养基 进行优化 ,确定发酵培养基组成 , 进一步提高菌株 γ2
M gSO4 、 M nSO4 、 CaC l2 ) 的重要性进行考查 , 每个因素
1 材料与方法
111 菌种
解淀粉芽孢杆菌 L536 ( B acillus am y loliquefaciens L536 ) ,由山东省食品发酵工程重点实验室分离并保 存。
112 培养基
取高低两种水平 , 高水平约为低水平的 1125 倍 。实 验选取的各因素水平取值见表 1。用 m initab 软件对 实验数据进行处理 ,比较各因素的 t值和可信度 。
X1 X2 X3
γ2PGA / ( g・L
2415 2510 2218 2113 2218 2512 2013 2310 2218 2517 2510 2612 2313 1916 2417
)
来源 回归 一次项 二次项 交互作用 残差误差 纯误差
R
2
自由度
9 3 3 3 5 2 98113% 94178%
11412 最陡爬坡实验设计
斜面培养基 ( g /L ) : 蛋白胨 10, 酵母膏 5, NaC l
10,琼脂 20, pH 值 710 - 712。
最陡爬坡实验以 Plackett2 B ur m an 实验实验值的 变化方向为爬坡方向 , 根据 Plackett2 B urman 实验结 果各因素效应值的大小确定变化步长 ,最快的逼近最 佳值区域 。正效应的因素选取较高值 ,负效应的因素 选取较低值 。γ2 聚谷氨酸产率最高的处理 ,即为下一 步响应面分析的中心点 。
Glu )单体通过 γ2 羧基与 α2 氨基缩合形成的酰胺键聚
10,葡萄糖 1, pH 值 710。 113 试验方法 11311 培养方法
种子培养 : 250 mL 三角瓶装种子培养基 30 mL ,
011 MPa灭菌 20 min,接种摇瓶培养 ,摇床转速 180 r/min,
合而成的一种多肽分子
g/L、 M nSO4 0135 g/L、 CaCl2 012 g/L ,在此条件下 ,γ2PGA 发酵产率为 25181 g /L ,比优化前提高了约 115 倍 。
γ2 关键词 聚谷氨酸 ,响应面法 ,优化 ,培养基
γ2 聚谷氨酸 (γ2 polyglutam ic acid,γ2PGA ) 是微生 物产生的胞外氨基酸聚合物 ,是一种水溶性的新型生 物高分子材料 , 由 L 2 谷 氨酸 ( L 2Glu ) 、 D2 谷 氨酸 ( D 2
由于豆粕 、 M nSO4 有显著正效应 , 应增加 ; NH4 Cl 有显著负效应 ,应减少 。这 3 个显著因素的变化方向 及步长的实验设计及结果见表 4。
表 4 最陡爬坡实验设计及结果
序号
1 2 3 4 5 6 7
2 结果与讨论
211 Plackett2Burman 实验
豆粕 /
( g・L - 1 ) 40 45 50 55 60 65 70
T - 1101 10197 - 3175 2131 - 4151 2196 1105 4188 - 0113
P 01418 01008 01064 01147 01046 01098 01402 01040 01907
重要性排列
8 1 4 6 3 5 7 2 9
豆粕 / ( g・L - 1 ) 柠檬酸钠 / ( g・L - 1 ) 谷氨酸钠 / ( g・L ) NH4 Cl/ ( g・L - 1 )
SO4 、 NH4 C l为主要影响因素进行下一步实验 。
2010 年第 36 卷第 3 期 (总第 267 期 )
109
食品与发酵工业
FOOD AND FERMENTATION INDUSTR IES
表 7 回归方程的方差分析
-1
表 6 Box 2Behnken 实验设计及结果
试百度文库号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 2 2 2 2 1, 2
摘 要 采用响应面试验对 1 株 γ2 聚谷氨酸产生菌的发酵培养基进行优化 ,得到的产 γ2PGA 发酵培养基组合 为 : NaCl 15 g/L、 豆粕 53 g /L、 柠檬酸钠 16 g/L、 谷氨酸钠 40 g/L、 NH4 Cl 416 g /L、 K2 HPO4 01625 g/L、 M gSO4 1125
MnSO 4 ・H2 O / g・L
-1
NH4 Cl/ ( g・L - 1 ) 7 6 5 4 3 2 1
γ2PGA /
( g・L - 1 ) 1916 1918 2114 2013 1817 18111 16185
按照 N = 9 的 Plackett2 Bur m an 设计进行实验 , 每 组 3 个平行 ,摇瓶发酵的结果取其平均值 , 响应值为 γ2 聚谷氨酸产率 。 Plackett2 B urman 实验设计及响应 值见表 2,各因素效应及显著性分析见表 3。