HPLC法测定人体尿液中有机酸的含量

HP LC 法测定人体尿液中有机酸的含量

高素莲1,周宁国2,王雪梅1

(1.安徽大学化学化工学院,安徽合肥　230039;2.甘肃长颖投资开发有限公司,甘肃兰州　730000)

摘　要:以苯酚为内标物,用反相高效液相色谱法(RP -HP LC )测定了人体晨尿中尿酸(UA )、

对-氨基苯甲酸(P -ABA )、马尿酸(HA )、高香草酸(HVA )的含量;探讨了尿样预处理技术。该

法的检测限为0.23～0.59ng;回收率为97.65%～98.49%;相对标准偏差为1.05%～2.73%。本

文建立的分析方法可满足临床胃癌、肺癌等病人的尿液中有机酸的监测与诊断。

关键词:高效液相色谱法;尿酸;马尿酸;高香草酸;对-氨基苯甲酸

中图分类号:O657.7+4 文献标识码:A 文章编号:1000-2162(2005)04-0075-04

尿酸(UA )、马尿酸(HA )、高香草酸(HVA )和对-氨基苯甲酸(P -ABA )在尿液中的含量变化可以反应肝脏、肾脏的实质性病变。某些肿瘤病人的尿液中HVA 的含量显著提高;某些职业病人,如甲苯、铅中毒也会引起它们含量明显变化。因此,研究人体尿液中有机酸的分离测定在临床与职业病防治方面有重要意义[1-2]。国内外相继报道了用高效液相色谱荧光法[3]、电化学法[4]、紫外法[5]

及紫

外-电化学法[6]测定尿液中某些有机酸,但大多数需要复杂的样品前处理,且效果不佳。用反相高

效液相色谱(RP -HP LC )紫外法同时测定上述4种有机酸与其病变关系尚未见报道。本文中采用RP -HP LC 紫外和内标法对正常成人、胃癌、肺癌病人各15例晨尿中UA,HA,HVA 及P -ABA 的含量进行定性定量测定,为临床分析提供了简便、快速、准确的分析方法。1　实验部分

1.1　仪器与试剂

日本岛津高效液相色谱仪(LC -6A 型);日本岛津紫外扫描仪(UV -265);离心机(国产G L -10A 型)。

K OH,Na 2CO 3,KH 2P O 4,HCl,醋酸、甲醇、乙腈、乙酸乙酯均为分析纯;苯酚、尿酸、对-氨基苯甲酸、马尿酸、高香草酸均为色谱纯;二次蒸馏水。

1.2　标准样品混合液的配制

(1)称取尿酸20.8mg,置于10mL 容量瓶中,用11.6m mol ・L -1Na 2CO 3溶液定容,于70℃水浴中溶解,标记为1#

。

(2)称取一定量的对-氨基苯甲酸、马尿酸、高香草酸和苯酚,分别置于10mL 容量瓶中,用甲醇

定容,分别标记为2#-5#。再分别吸取1#-5#各1.0mL 置于50mL 棕色容量瓶中,用甲醇定容,即为

标准样品混合液。

1.3　样品溶液的制备

取5.0mL 尿液置于10mL 容量瓶中,加入1.0mL 的2.0mg ・mL -1的苯酚,用6mol ・L -1HCl 调

pH 为2.02,再用二次蒸馏水定容,以3500r ・m in -1离心10m in,在-20℃冰箱中保存。上机前经

0.45μm 滤膜过滤。收稿日期:2004-09-17

作者简介:高素莲(19462),女,安徽五河人,安徽大学教授,硕士生导师.

2005年7月

第29卷第4期安徽大学学报(自然科学版)Journal of Anhui University Natural Science Editi on July 2005Vol .29No .4

1.4　色谱条件

色谱柱:whet m an ODS,250×4.6mm i ・d;

流动相:甲醇:0.01mol ・L -1KH 2P O 4(用醋酸调pH 为3.02)=30∶70(V /V );

流速:1.0mL ・m in -1

;

检测波长:尿酸、马尿酸在254n m ,对-氨基苯甲酸、高香草酸在280nm 。

1.5　样品定性定量测定在实验选定的色谱条件下,分别对标准样品混合液和样品提取液进行分析,采用保留时间对照法、改变流动相组成和pH 值法、增量法对尿液中的UA ,HA ,P -ABA ,HVA 进行了定性。结果如图1所示

。

图1　标样混合样(A )和尿样(B )的谱图(在λ254n m )

峰序:1-UA,2-p -ABA,3-HA,4-HVA,5-苯酚

以苯酚为内标物的内标法对正常成人、胃癌、肺癌病人各15例的晨尿液进行分析,分析结果如表1所示。

表1　尿液中有机酸的含量测定(mg .mL -1)

样品

UA P -ABA HA HVA 正常成人尿液

0.5940.3480.0020.015胃癌病人尿液

0.4280.4290.0970.128肺癌病人尿液0.2810.1710.1640.035

2　结果与讨论

2.1　最佳检测波长的选择

用日本岛津紫外扫描仪对各标准样品溶液快速扫描。尿酸、马尿酸、高香草酸、对-氨基苯甲酸和苯酚均有2组特征吸收峰;尿酸、马尿酸在254n m 的吸收比280n m 吸收更强,而对-氨基苯甲酸,高香草酸则相反。尿酸,马尿酸的最佳检测波长为254n m ,对-氨基苯甲酸、高香草酸的最佳检测波长为280n m 。

2.2　流动相组成的选择

以甲醇-KH 2P O 4缓冲液为流动相的基本组成体系,分别用盐酸和醋酸对0.01mol ・L -1

KH 2P O 4缓冲液pH 值进行调节。用盐酸调节流动相的各标准样品的保留时间略有增长,但重复性、分离效果不如醋酸调节pH 值,且醋酸含量变化对内标物苯酚影响不明显,这与文献[1]的报道一致;在

67安徽大学学报(自然科学版)第29卷