检测禽流感病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法的建立_张立怀

8 0.190
9 0.228
10 0.300
平均值为 0.218，当 P/N ≥ 2.1，即 A450 ≥ 0.457 时，结果 判为阳性，否则判为阴性。本方法对禽流感病毒的最低检出 量为 10 µg/ml，见表 4。
表 4 最低检出量的测定
检测抗原类型 H5 亚型 H7 亚型 H7 亚型
最小检出量（µg/ml） 9 11 12
1:12 800 1.981 1.910 1.292 0.449 0.263 0.184
多抗稀释度 1:25 600 1.549 1.491 0.932 0.357 0.224 0.226
1:51 200 1.169 1.088 0.685 0.258 0.205 0.201
1:102 400 0.867 0.814 0.498 0.251 0.193 0.153
可以在养禽生产以及进出口检疫中作为禽流感诊断的辅助 手段。
本研究采用了自己研制的具有群特异性的单克隆抗体 作为捕获抗体，建立了可以检测所有亚型禽流感病毒的 ELISA 检测技术。对 H5、H7 和 H9 病毒株的检测结果已 经显示了这一能力。由于没有更多的病毒株，对其他亚型病 毒株的检测结果有待补充。
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阴性样本 A值
1 0.258
2 0.220
3 0.217
表 3 阴性样本测定结果
4 0.189
5 0.175
6 0.193
7 0.208
图 1 纯化多抗 SDS-PAGE 图
2.2 腹水的纯化 采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，测定纯化前后腹水
的效价并进行 SDS-PAGE 分析。结果分别见表 1、图 2 和 图 3，从表中和图上可知，腹水的效价至少可以达到 1.28 ×
表 1 提纯前后腹水效价的测定
单抗稀释度
1:10 000 1:20 000 1:40 000 1:80 000 1:160 000 1:320 000 1:640 000 1:1 280 000
ELISA A 值 1× 104 2× 104 4× 104 8× 104 16× 104 32× 104 64× 104 128× 104
1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
0
单抗稀释度
图 2 提纯前后腹水效价的测定曲线
1
97 2000wk.baidu.com66 4000 44 3000
29 0000
63
1.2.4 双抗夹心 ELISA 方法对禽流感病毒最低检出量的 测定 测定 10 个阴性样本的 A 值，计算出阴性样本的平 均值，当 P/N ≥ 2.1 时结果判为阳性。分别将经差速离心 法超离纯化的 H5、H7、H9 3 个亚型禽流感尿囊液进行一 系列的稀释，根据确定的反应程序进行测定。
2 结果
阴性样本的测定结果如表 3 所示。计算出阴性样本的
包被单抗稀释度
1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:16 000 1:32 000
表 2 单抗最适包被浓度和多抗最佳工作浓度的确定
1:3200 2.444 2.310 1.853 0.753 0.402 0.284
1:6400 2.321 2.213 1.713 0.638 0.323 0.228
作者单位：300456 天津出入境检验检疫局（张立怀、霍蕾、侯艳梅）； 100081 北京，中国农业大学（张国中） 通讯作者：侯艳梅，Email：houym@tjciq.gov.cn 收稿日期：2008-12-10
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1 材料与方法
1.1 主要材料 1.1.1 病毒与试剂 禽流感病毒与鸡抗血清由中国农业大 学实验动物所病毒室提供；兔抗鸡酶标二抗（HRP）和单克 隆抗体细胞株（16A1）由中国农业大学实验动物所病毒室 制备；正辛酸（化学纯）购自军事医学科学院药材供应站； TMB 底物购自华美生物工程公司。 1.1.2 主要仪器 台式电子天平购自 ACCULA 公司； LD5-2A 台式离心机购自北京医用离心机厂；恒温培养箱购 自湖北省黄石市医疗器械厂；自动酶联检测仪购自 Anthos Labtee Instruments Gmbh 公司；超声裂解仪购自 Cole-Parmer Instrument 公司；紫外分光光度计购自 Pamarcia LKB 公 司；酸度计购自 Aerospace computer 公司。
3 讨论
本研究采用禽流感病毒群特异性单克隆抗体，通过对抗 体纯化，对单抗包被浓度和多抗最佳工作浓度、样品处理方 法、最适反应时间的确定，初步建立了检测禽流感病毒抗原 的双抗体夹心 ELISA 方法，研究表明建立的该方法对不同 亚型的禽流感病毒都有相对较好的检出，其最小检出量分 别达到了 9 µg/ml、11 µg/ml 和 12 µg/ml。该方法经过优化
提纯前 1.093 1.099 0.962 0.852 0.767 0.680 0.434 0.269
ELISA 结果（A） 提纯后 1.194 1.067 1.052 1.018 0.913 0.852 0.620 0.516
对照 0.059 0.057 0.049 0.053 0.046 0.060 0.047 0.048
2.1 禽流感病毒阳性血清 IgG 的提取 采用饱和硫酸铵盐析法提取禽流感病毒阳性血清的
IgG，提纯后进行 SDS-PAGE 分析，结果见图 1。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
97 2000 66 4000 44 3000
29 0000
20 1000 14 3000
1：低分子量蛋白 Maker；2 ~ 5：同时进行的其他实验抗体电泳的情况； 6 ~ 7：不同上样量未纯化多抗；8 ~ 10：不同上样量的纯化多抗；图旁 数字示相对分子质量
进出口检疫由于涉及的禽类对象来源广，其可能携带禽 流感病毒不可能局限于 1 个或几个亚型，因此针对单一亚 型禽流感病毒的技术不能满足快速检测的要求。由于禽流感 病毒的核蛋白（NP）具有型的特异性，针对 NP 的单抗具 有检测所有禽流感病毒的潜力，以 NP 的单克隆抗体为基 础建立快速诊断方法可以高效地进行进出境禽类产品的禽 流感病毒检测。本研究利用实验室制备的针对禽流感病毒 NP 的特异性单克隆抗体作为捕获抗体，建立了针对所有亚 型禽流感病毒的、适用的、成本较低的快速检测方法。
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·技术与方法·
检测禽流感病毒抗原的双抗体夹心
ELISA 方法的建立
张立怀，张国中，霍蕾，侯艳梅
禽流行性感冒（avian influenza，AI）简称禽流感，是 由正粘病毒科流感病毒属 A 型流感病毒引起的禽类传染 病。高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza， HPAI）被世界动物卫生组织（world organization for animal health，OIE）列为 A 类传染病。我国也把禽流感列为一类 动物疫病。禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）可感 染几乎所有野生禽及家禽，AI 的暴发和流行，给养禽业造 成了巨大的经济损失[1]，且和其他动物流感有紧密联系，并 威胁着人类的健康[1-2]。1997 年在香港[2]、2003 年在荷兰[3]、 2004 年以来每年在东南亚都有人感染 AI 而死亡的报道， 因此防控禽流感已成为全世界的一项重要任务。
1.2 方法 1.2.1 鸡抗禽流感病毒阳性血清 IgG 的提取 取鸡禽流 感病毒阳性血清 10 ml，加入等量的生理盐水稀释，逐滴加 入饱和硫酸铵 20 ml，使之达 50% 饱和度，边加边搅拌， 用浓氨水调节 pH 值至 7.0，置 40 ℃ 30 min 以上。室温 平衡后，1200 × g 离心 30 min 以上，弃上清。用 20 ml 生 理盐水溶解沉淀，逐滴加入饱和硫酸铵 10 ml，使之达 33% 饱和度。 同上调节 pH 值、放置室温平衡及离心处理，重 复 3 次。将最后一次离心所得沉淀溶于 2 ml 生理盐水装 入透析袋，用生理盐水透析 24 h，其间换液 2 ~ 3 次。所 得透析物进行 SDS-PAGE 分析，–20 ℃ 保存备用。 1.2.2 腹水的纯化 将每只小鼠腹腔接种杂交瘤细胞 16A1 106 个。10 d 后，见小鼠腹部明显增大，采集腹水。 将腹水 3000 × g 离心 10 min，收集上清。采用辛酸-饱和 硫酸铵法纯化。将 1 份腹水加入 2 份 0.06 mol/L pH4.0 NaAc-HAc 缓冲液，边加边搅拌，加入 1 mol/L NaOH 调混 合液为 pH4.8，加入正辛酸 33 µl/ml 腹水，搅拌 30 min。 4 ℃ 4000 × g 离心 30 min，弃沉淀，加入 1 mol/L NaOH 调 混合液为 pH7.2，加入等量饱和硫酸铵，边加边搅拌（50%）， 继续搅拌 20 min，4 ℃ 4000 × g 离心 30 min，弃上清。沉 淀加入 5.5 ml 0.01 mol/L pH7.2 PBS 溶解，加入饱和硫酸铵 4.5 ml，边加边搅拌（45%），继续搅拌 20 min，4 ℃ 4000 × g 离心 30 min，弃上清，沉淀溶于少量 0.01 mol/L pH7.2 PBS，装入透析袋透析。透析 24 h 后收获透析物，–20 ℃ 保 存备用。测定纯化前后腹水的效价并进行 SDS-PAGE 分析。 1.2.3 双抗体夹心 ELISA 方法的建立 经辛酸-饱和硫 酸铵法提纯的单抗 16A1 稀释成 1000、2000、4000、8000、 16 000、32 000 的 6 个浓度，进行包被，经饱和硫酸铵盐 析法提纯的多抗稀释成 3200、6400、12 800、25 600、51 200、 102 400 的 6 个稀释度，按单抗包被→待检病料→鸡多 抗→兔抗鸡二抗（HRP）→底物显色→终止显色的实验程序 采用方阵法测定单抗 16A1 最适包被浓度和多抗最适工作 浓度。分别将各步的反应时间设立为 10、30、60 min，确 定最佳反应时间。根据上述指标测定，确定最终反应程序。
目前检测禽流感病毒的技术包括病毒的分离鉴定，PCR 或荧光 PCR 方法和抗原捕获 ELISA。由于病毒分离鉴定 需要很长的时间和严格的无菌操作，PCR 或荧光 PCR 方 法需要昂贵的设备和受过特殊专业培训的人员，因而限制了 它们的广泛使用。有关研究人员一直探讨利用单克隆抗体技 术检测禽流感病毒，并建立了一些相关技术。
234
5
6
7
20 1000
14 3000
1：低分子量蛋白 Maker；2 ~ 4：不同上样量的纯化腹水；5 ~ 7：不同 上样量的未纯化腹水；图旁数字示相对分子质量
图 3 纯化腹水 SDS-PAGE 图
106，腹水经辛酸-饱和硫酸铵法纯化效果较好。 2.3 双抗体夹心 ELISA 方法的建立
单抗 16A1 最适包被浓度和多抗最适工作浓度如表 2 所示，根据尽可能提高单抗包被量以增加对不同亚型禽流感 病毒捕捉能力的原则，可以确定单抗的包被浓度为 1:4000 倍稀释，相应多抗的最佳稀释度为 12 800 ~ 25 600 之间， 我们在试验中使用 1:20 000 倍稀释的多抗。最适反应时间 为 37 ℃ 60 min。据上述指标的测定结果，确定最终反应程 序为：单抗 16A1 包被，4 ℃ 12 h；洗涤 3 次，1% 明胶 封闭，37 ℃ 作用 60 min；洗涤 3 次，加入待检样品，37 ℃ 作用 60 min；洗涤 3 次，加入多抗 IgG，37 ℃ 作用 60 min； 洗涤 3 次，加入兔抗鸡二抗（HRP），60 min；洗涤 3 次， 加入 TMB 底物，37 ℃ 显色 15 min；加入 2 mol/L H2SO4 终止显色。自动酶联检测仪 A450 读数。 2.4 双抗夹心 ELISA 方法对禽流感病毒最低检出量的测定