实验一 蛋白质的变性、凝固及沉淀反应
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▪ 生物碱试剂沉淀蛋白质在生化分析中有何意义。 ▪ 重金属离子沉淀蛋白质在临床上有何意义，其原
理是什么？
变性、沉淀与凝固的关系
变性：蛋白质特定的空间构象被破坏而导致其
理化性质的改变和生物活性的丧失。一定条件 下可复性。
沉淀：蛋白质颗粒失去电荷、脱水，以固态的
形式从溶液中析出。
凝固：
操作步骤
1.蛋白质热变性：
2. 蛋白质的盐析作用
0.3g
3、重金属离子沉淀蛋白质：
取试管一只，加入: 蛋白液1mL+0.1mol/L NaOH 2滴+CuSO4溶液， 随加随摇匀，至出现沉淀为止。
1.蛋白质胶体分子的稳定因素。
掌握:
1.蛋白质变性的原理。
重 点: 蛋白质两性反应和等电点。 难 点: 蛋白质沉淀反应的原理和意义。
蛋白质的理化性质
▪ 蛋白质的两性电离性质 ▪ 蛋白质的变性 ▪ 蛋白质的胶体性质 ▪ 蛋白质的紫外吸收特性 ▪ 蛋白质的呈色反应
蛋白质的两性解离：
pH < pI 阳离子
4、生物碱试剂沉淀蛋白质：
取试管一只，加入: 蛋白液1mL，滴加饱和苦味酸6滴，观察并 解释所见。
注意事项:
1. 严格操作，逐滴加入，边加边摇晃。 2. 酒精灯加热，务必正确操作，严防液体 喷出伤
人。 3. 苦味酸属危险试剂，注意安全。
思考题
▪ 请简述蛋白质热变性的基本原理，日常生活中你 观察到那些热变性现象。
属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+等）结合形成不溶性蛋白 盐类而沉淀。
特点：重金属沉淀蛋白质的反应通常很完全，属于不可 逆的沉淀反应。 应用：生活中；科研分析；临床上
点豆腐：蛋白质（胶体）颗粒的沉淀。
3. 生物碱试剂沉ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ蛋白质
原理：在酸性溶液中，蛋白质带正电荷，易与生物碱
试剂作用形成沉淀。
常用的生物碱试剂：鞣酸、苦味酸、三氯醋酸、钨酸等。 特点：也属于不可逆的沉淀反应。 应用：在生化分析中常用来制备无蛋白质滤液。
蛋白质的变性：如加剧如热烈酸、震、超荡碱金声、、属波搅有盐、拌机类紫等溶 等外剂线、、重
在某些物理和化学因素作用下，其特定的空 间构象被破坏而导致其理化性质的改变和生物 活性的丧失，称为蛋白质的变性。
变性
复性
※ 特点：一级结构未被破坏，一定条件下可。
蛋白质的热变性
热变性：由于加热而导致的蛋白质变性。
实验一 蛋白质的变性、凝固及沉淀反应
申晓冬 讲师
Tel: 752943 Email：shenxiaodong77@
第三军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室
授课对象：
临床医学五年制本科
使用教材：
杨安钢主编，《生物化学与分子生物学实验技术》， 高等教育出版社，2008年出版。
推荐网站：
第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： http://192.168.4.133:8002/ 中国生物信息网：ttp://
教学目标与要求：
了解:
1. 盐析、重金属离子和生物碱试剂沉淀蛋白质的原理。 2. 通过实验了解蛋白质的变性、凝固和沉淀的相互关系。
理解:
1. 盐析
原理：溶液的蛋白质胶体分子在高浓度中性盐作用下，蛋
白质脱去水化膜并中和所带的电荷，使蛋白质的胶体稳定 性遭到破坏而沉淀析出。
特点：沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质性质，若降低盐的 浓度蛋白质仍可溶解。 应用：常用于提纯各种蛋白质及酶类。
2. 重金属离子沉淀蛋白质
原理：在碱性溶液中，使蛋白质带负电荷易与重金
蛋白质变性与凝固的关系
二、蛋白质的沉淀反应
维持蛋白质分子胶体稳定性的两个主要因素－－ 水化层、电荷层
➢ 表面电荷 ➢ 水化膜
蛋白质沉淀的原理
沉淀析出
蛋白质的沉淀：
在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失 去电荷、脱水，即以固态的形式从溶液中析出， 称为蛋白质的沉淀。
盐析、重金属盐类和生物碱试剂
pH = pI 兼性离子
pH > pI 阴离子
蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）：
当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正负离子的趋势相等，即 成为兼性离子，净电荷为零。此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。
※ 在等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易沉淀析出。
一、蛋白质的加热变性凝固
蛋白质在50℃～60℃以上的溶液中，由于热的作用，多肽链的 运动加强，导致次级键的破坏，蛋白质由紧密有序的构象，变 成松散无规律的构象。此时蛋白分子中某些疏水基团外露，失 去原有的亲水性，成为溶解度很低的变性蛋白。
凝固：若在等电点情况下加热（或加乙醇） ，
则蛋白质可凝固而沉淀析出；若将蛋白质加热 （或加乙醇）后将溶液的pH值调到等电点，变性 蛋白质立即结成絮状的不溶解物析出，称为结絮。 结絮的蛋白质再加热则可凝固。
理是什么？
变性、沉淀与凝固的关系
变性：蛋白质特定的空间构象被破坏而导致其
理化性质的改变和生物活性的丧失。一定条件 下可复性。
沉淀：蛋白质颗粒失去电荷、脱水，以固态的
形式从溶液中析出。
凝固：
操作步骤
1.蛋白质热变性：
2. 蛋白质的盐析作用
0.3g
3、重金属离子沉淀蛋白质：
取试管一只，加入: 蛋白液1mL+0.1mol/L NaOH 2滴+CuSO4溶液， 随加随摇匀，至出现沉淀为止。
1.蛋白质胶体分子的稳定因素。
掌握:
1.蛋白质变性的原理。
重 点: 蛋白质两性反应和等电点。 难 点: 蛋白质沉淀反应的原理和意义。
蛋白质的理化性质
▪ 蛋白质的两性电离性质 ▪ 蛋白质的变性 ▪ 蛋白质的胶体性质 ▪ 蛋白质的紫外吸收特性 ▪ 蛋白质的呈色反应
蛋白质的两性解离：
pH < pI 阳离子
4、生物碱试剂沉淀蛋白质：
取试管一只，加入: 蛋白液1mL，滴加饱和苦味酸6滴，观察并 解释所见。
注意事项:
1. 严格操作，逐滴加入，边加边摇晃。 2. 酒精灯加热，务必正确操作，严防液体 喷出伤
人。 3. 苦味酸属危险试剂，注意安全。
思考题
▪ 请简述蛋白质热变性的基本原理，日常生活中你 观察到那些热变性现象。
属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+等）结合形成不溶性蛋白 盐类而沉淀。
特点：重金属沉淀蛋白质的反应通常很完全，属于不可 逆的沉淀反应。 应用：生活中；科研分析；临床上
点豆腐：蛋白质（胶体）颗粒的沉淀。
3. 生物碱试剂沉ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ蛋白质
原理：在酸性溶液中，蛋白质带正电荷，易与生物碱
试剂作用形成沉淀。
常用的生物碱试剂：鞣酸、苦味酸、三氯醋酸、钨酸等。 特点：也属于不可逆的沉淀反应。 应用：在生化分析中常用来制备无蛋白质滤液。
蛋白质的变性：如加剧如热烈酸、震、超荡碱金声、、属波搅有盐、拌机类紫等溶 等外剂线、、重
在某些物理和化学因素作用下，其特定的空 间构象被破坏而导致其理化性质的改变和生物 活性的丧失，称为蛋白质的变性。
变性
复性
※ 特点：一级结构未被破坏，一定条件下可。
蛋白质的热变性
热变性：由于加热而导致的蛋白质变性。
实验一 蛋白质的变性、凝固及沉淀反应
申晓冬 讲师
Tel: 752943 Email：shenxiaodong77@
第三军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室
授课对象：
临床医学五年制本科
使用教材：
杨安钢主编，《生物化学与分子生物学实验技术》， 高等教育出版社，2008年出版。
推荐网站：
第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： http://192.168.4.133:8002/ 中国生物信息网：ttp://
教学目标与要求：
了解:
1. 盐析、重金属离子和生物碱试剂沉淀蛋白质的原理。 2. 通过实验了解蛋白质的变性、凝固和沉淀的相互关系。
理解:
1. 盐析
原理：溶液的蛋白质胶体分子在高浓度中性盐作用下，蛋
白质脱去水化膜并中和所带的电荷，使蛋白质的胶体稳定 性遭到破坏而沉淀析出。
特点：沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质性质，若降低盐的 浓度蛋白质仍可溶解。 应用：常用于提纯各种蛋白质及酶类。
2. 重金属离子沉淀蛋白质
原理：在碱性溶液中，使蛋白质带负电荷易与重金
蛋白质变性与凝固的关系
二、蛋白质的沉淀反应
维持蛋白质分子胶体稳定性的两个主要因素－－ 水化层、电荷层
➢ 表面电荷 ➢ 水化膜
蛋白质沉淀的原理
沉淀析出
蛋白质的沉淀：
在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失 去电荷、脱水，即以固态的形式从溶液中析出， 称为蛋白质的沉淀。
盐析、重金属盐类和生物碱试剂
pH = pI 兼性离子
pH > pI 阴离子
蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）：
当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正负离子的趋势相等，即 成为兼性离子，净电荷为零。此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。
※ 在等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易沉淀析出。
一、蛋白质的加热变性凝固
蛋白质在50℃～60℃以上的溶液中，由于热的作用，多肽链的 运动加强，导致次级键的破坏，蛋白质由紧密有序的构象，变 成松散无规律的构象。此时蛋白分子中某些疏水基团外露，失 去原有的亲水性，成为溶解度很低的变性蛋白。
凝固：若在等电点情况下加热（或加乙醇） ，
则蛋白质可凝固而沉淀析出；若将蛋白质加热 （或加乙醇）后将溶液的pH值调到等电点，变性 蛋白质立即结成絮状的不溶解物析出，称为结絮。 结絮的蛋白质再加热则可凝固。