小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养

一、实验材料

1.主要仪器设备

(1)倒置显微镜（Olympus，Japan）

(2)CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司）

(3)100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂）

(4)6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm）

(5)Eppendroff管

(6)1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿

(7)离心机

(8)5ml冻存管

(9)两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）

2.主要试剂配制

(1)MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液

——低糖DMEM母液

1)用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公

司）；

2)将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并

冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。

3)每升培养基中添加3.7gNaHCO3。

4)搅拌直至完全溶解。

5)用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容

器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。

6)立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。

——MEF培养液

取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的

新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。

(2)PBS

在500ml超纯水中依次溶入

NaCl 4.0g

KCl 0.1g

Na2HPO4.12HO2 1.445g

KH2PO40.1g

于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。

(3)0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液

在100ml超纯水中分别溶解

胰蛋白酶干粉(Trypsin, Sigma,T4799) 0.25g

EDTA 0.02g

NaCl 0.7g

Na2HPO4.12HO20.024g

KH2PO40.024g

KCl 0.037g

Tris 0.3g

D-葡萄糖0.1g

酚红1mg

于4℃过夜，使之充分溶解，用1mol/lHCl调PH至7.6, 0.22um的滤器过滤除菌，在–10～30℃下冻存备用。

(4)0.1%的明胶水溶液

称明胶0.1g （Sigma, G—9391）溶于100ml超纯水中，先加热溶解，再分装入20ml的血清瓶中于121℃高压灭菌45min，于4℃保存。

(5)10ug/ml的丝裂霉素C工作液

1) 0.5mg/ml的丝裂霉素C母液

在盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml高压灭菌的PBS，用高压灭菌的尖嘴混匀。即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。

注：此步应在胶卷暗盒内操作，然后于4℃避光保存。

2) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液

在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液，并经0.22um的滤器过滤至25ml血清瓶中。用前临时配制，并在37℃的CO2培养箱中预温30min.。

(6)冻存液

取2支1.5ml Eppendroff管，每管均加入0.9ml DMEM（低糖型）培养液和0.1ml二甲基亚砜（DMSO，AR纯，中国医药集团上海化学试剂公司），置40C冰箱中预冷60min。

3.动物：

性成熟期即大于8周龄昆明种小白鼠，领自福建医科大学实验动物中心。

二、实验步骤

1.获取小鼠胚胎

(1)将8周龄的昆白♀鼠和12周龄的昆白♂按1:1比例合笼。

(2)次日晨10:00前观察♀鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物（阴道栓）即定为怀孕0.5天。

(3)实验时断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。

(4)75％酒精消毒后，用普通剪刀和镊子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤

向头尾两侧牵拉即剥皮。

(5)用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。

(6)用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离

下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。

(7)将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。

(8)在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。

(9)将子宫移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，

并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。

(10)将胎鼠移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚

躯干。

(11)将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。

2.小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块培养法）

(1)将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪充分剪碎，剪成

约1mm3以下的碎块（需剪约200下）。

(2)用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底离心管中。

(3)室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。

(4)向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液，轻轻吹吸30

秒（可见组织块变得较为粘稠）。

(5)再加入1 mlMEF培养液终止消化，室温下静置5min。

(6)吸去上清液，留下鼠胚组织碎块沉淀。

(7)每个离心管内加入5mlMEF培养液悬浮鼠胚组织块，并接种到100ml的螺口的培养瓶中（接

种时应用滴管将组织块混匀）。

(8)做好标记（如培养日期，细胞名称，编号），将装有鼠胚组织碎块的培养瓶放入37℃，5％CO2，

100％RH的培养箱中培养。

(9)培养的头两天不要晃动培养瓶，第三天可以观察，可见组织碎块附着于培养瓶底，周围细胞

呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是呈圆形的上皮细胞。如果细胞已全部长满则可消化传代，如果未全部长满则可3/4换液或全量换液。

3.小鼠胚胎成纤维细胞的传代培养：

(1)用滴管吸弃培养瓶中的培养液和未贴壁生长的组织块。

(2)每瓶用滴管加入约3ml的PBS，轻轻前后晃动培养瓶，洗涤细胞一遍，吸弃PBS。

(3)每瓶用滴管加入约2ml的0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液，能盖住培养瓶底，室温

下静置作用30秒，吸弃消化液。

(4)在倒置镜下观察，当细胞变圆时即可加入4—5mll MEF培养液终止消化，并用滴管吸培养液

用力吹打整个瓶底（约30下）。

(5)将培养物全部吸置尖底离心管内，静置5min，将上层细胞悬液吸置另一离心管内。

(6)1000r/min（80-1离心机为80g）离心5min，吸弃上清液。

(7)每瓶加入3mlMEF培养液悬浮细胞沉淀块，并分装至3个100ml的培养瓶中。

(8)每个培养瓶再补加4ml的MEF培养液，并吹打混匀细胞（吹打时勿产生气泡）。

(9)将刚消化传代的细胞在倒置镜下观察，可见细胞呈大小不一的圆形。

(10)将装有消化后细胞的培养瓶放入37℃，5％CO2，100％RH的培养箱中培养。

(11)约2天后，细胞可贴壁长满，继续按1:3消化传代（操作同前，省略步骤5中的静置和换管）。

4.饲养层制备

(1)明胶预包被培养板：取1个6孔培养板（COSTAR ,每孔直径为3.5cm），先紫外照射30min，

每孔用5ml刻度滴管加入3ml的0.1%明胶水溶液，使其能覆盖孔的底部，室温下静置2h以上，用前吸弃明胶水溶液，并用2ml的PBS洗涤一遍。

(2)丝裂霉素C作用2小时：将3瓶细胞生长连成一片的第3代MEF的培养液吸弃，每瓶加入

3ml10ug/ml的丝裂霉素C工作液，再放入37℃、5%CO2、RH100%的培养箱中培养2h。

(3)2小时后，吸弃培养瓶中的丝裂霉素C工作液，用预温的PBS洗涤细胞5次，每次3ml（加

样时滴管靠在培养瓶的上壁或侧壁，勿直接冲冲击底壁的细胞）。

(4)消化：每瓶中加入2ml0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA消化液，室温下作用10秒，立即吸弃消

化液，加入3mlMEF培养液终止消化，并吹打壁底细胞（应注意逐瓶操作，避免消化时间过长而使细胞丢失过多）。

(5)离心：将所有细胞悬液分吸至2个10ml尖底离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，得细