蛋白质与蛋白质相互作用研究方法加实例演示文稿
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单独的BD或AD都不能激活基因转录，但不同转录激活 因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活 转录的功能。
如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。
与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。
如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活 报告基因(reporter gene)的转录与表达。
通过检测报告基因的表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物” 这两个蛋白质之间是否存在相互作用。
1.1 ຫໍສະໝຸດ Baidu母双杂交技术的原理
同时将上述两种载体转化改造后的酵母， 这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能 产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、 HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的 培养基上无法正常生长。当上述两种载体 所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能 重建的反式作用因子能够激活酵母基因组 中的报告基因HIS、ADE、LACZ、 MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选 到阳性菌落。
Tserendulam Batsukh, Yvonne Schulz,et.al.Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex.PLoS One. 2012; 7(12): e52640
Method： For yeast two hybrid studies we generated the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (transcript variant 1) and FAM124B-1,2pGADT7 (transcript variant 2) FAM124B-1,3-pGBKT7 (transcript variant 1, FAM124B-1,2pGBKT7 (transcript variant ),
1.2 酵母双杂交操作主要流程
BD AD
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞
x BD
3. 对酵母转化子进行自激活检测
4. 将重组载体共转化酵母菌细胞 5. 检测报告基因表达产物
BD AD
6. 分析酵母双杂交实验结果
Y
AD
实例
Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex
These both plasmids were co-transformed into Y2HGold strain cells together with either the CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181) or the CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789– 2302) plasmids.
Yeast two hybrid assay.
(A)Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, demonstrating no direct interaction between FAM124B transcript variant 1 and the CHD7 part, while (B) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, shows a direct interaction. The same experiments were performed for FAM124B transcript variant 2.
(C) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 15912181, (D) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, FAM124B transcript variant 2 interacts directly with the CHD8 part, while no direct interaction with the CHD7 part could be observed.
蛋白质与蛋白质相互作用研 究方法加实例演示文稿
优选蛋白质与蛋白质相互作 用研究方法加实例
一.酵母双杂交系统
1.1 酵母双杂交技术的原理
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建 立。他的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究.
基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也 需要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往 由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA 结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活结构 域(activation domain, AD), 它们都是转录激活因子发挥 功能所必需的。
如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。
与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。
如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活 报告基因(reporter gene)的转录与表达。
通过检测报告基因的表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物” 这两个蛋白质之间是否存在相互作用。
1.1 ຫໍສະໝຸດ Baidu母双杂交技术的原理
同时将上述两种载体转化改造后的酵母， 这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能 产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、 HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的 培养基上无法正常生长。当上述两种载体 所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能 重建的反式作用因子能够激活酵母基因组 中的报告基因HIS、ADE、LACZ、 MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选 到阳性菌落。
Tserendulam Batsukh, Yvonne Schulz,et.al.Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex.PLoS One. 2012; 7(12): e52640
Method： For yeast two hybrid studies we generated the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (transcript variant 1) and FAM124B-1,2pGADT7 (transcript variant 2) FAM124B-1,3-pGBKT7 (transcript variant 1, FAM124B-1,2pGBKT7 (transcript variant ),
1.2 酵母双杂交操作主要流程
BD AD
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞
x BD
3. 对酵母转化子进行自激活检测
4. 将重组载体共转化酵母菌细胞 5. 检测报告基因表达产物
BD AD
6. 分析酵母双杂交实验结果
Y
AD
实例
Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex
These both plasmids were co-transformed into Y2HGold strain cells together with either the CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181) or the CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789– 2302) plasmids.
Yeast two hybrid assay.
(A)Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, demonstrating no direct interaction between FAM124B transcript variant 1 and the CHD7 part, while (B) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, shows a direct interaction. The same experiments were performed for FAM124B transcript variant 2.
(C) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 15912181, (D) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 1789–2302, FAM124B transcript variant 2 interacts directly with the CHD8 part, while no direct interaction with the CHD7 part could be observed.
蛋白质与蛋白质相互作用研 究方法加实例演示文稿
优选蛋白质与蛋白质相互作 用研究方法加实例
一.酵母双杂交系统
1.1 酵母双杂交技术的原理
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建 立。他的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究.
基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也 需要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往 由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA 结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活结构 域(activation domain, AD), 它们都是转录激活因子发挥 功能所必需的。