肝母细胞瘤相关遗传变异及生物标记物

肝母细胞瘤相关遗传变异及生物标记物

肝母细胞瘤（hepatoblastoma，HB）是小儿最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，也是继神经母细胞瘤和肾母细胞瘤之后的小儿第三大常见的腹部恶性肿瘤[1]。14％的肝母细胞瘤见于新生儿，68％发生于2岁以内，90％发生于5岁以内。仅有3％的患者＞15岁。男性患病比例略高，1.5∶1～2∶1，但没有种族倾向。常见的临床表现有腹部膨隆、腹块、腹痛等。70%的患儿有血甲胎蛋白水平升高。手术和化疗是目前主要治疗措施。上世纪80年代以前，肝母细胞瘤的治愈率仅为30%。近年来，随着研究的深入和综合治疗的应用，肝母细胞瘤的治愈率已达到70%以上。尽管如此，肝母细胞瘤的病死率仍高达20 ～30%。最近通过基础与临床研究确定了许多与肝母细胞瘤相关的遗传学及生物学标记, 这些标记的获得可以帮助筛选病人,早期诊断, 预测预后和对肿瘤分层, 从而进行适当的治疗。许多预后研究也已经确定多种肿瘤标记物与肝母细胞瘤的总体生存率及无瘤生存率有关。然而, 目前很难确定哪一种标记物最有效, 这也表明了肿瘤复杂的本性以及尚缺少大样本的临床研究。现查阅近15 年国内外肝母细胞瘤研究文献，对与肝母细胞瘤筛查、诊断、预后及监测相关的部分遗传及生物标记物进行综述。

一、染色体变异

随着肝母细胞瘤相关染色体及基因研究不断进步。研究者们发现了许多染色体的变异。

在染色体的变异中染色体的获得多于染色体的丢失[2].其中最常见的变异为2、8和20号染色体的三体性。目前染色体杂交技术使研究者能够进一步的准确确定染色体的变异，并且能够定位肝母细胞瘤相关的基因片段。随着人类基因组计划的完成研究者利用基因芯片技术发现了许多染色体区域的变异，染色体2q 13-22, 2q 36-37的获得以及2p和 4q的丢失都与晚期的肿瘤及不良的预后相关[2-3].研究者还发现染色体1p 32, 1p 36.3, 以及11p 15.5杂合性的丢失，其中后者与 Beckwith–Wiedemann Syndrome关系密切，并且导致抑癌基因H19的丢失及胰岛素样生长因子-2(IGF-2)的两个等位基因的激活[2].高红等通过比较基因组杂

交(CGH)技术，对30例HB中染色体1p36上6个微卫星的杂合子丢失进行检测，结果每例HB细胞染色体均有不同程度的变异，30例HB中1号染色体上6个基因座发生LOH的总频率为63．3％，其中D1S199为最高，其次为D1S450。此研究认为HB存在多条染色体DNA拷贝数扩增或丢失的区域；HB在染色体1P36上存在广泛的LOH；染色体变异引起相应瘤基因扩增和抑癌基因的丢失可能参与了HB的发生、发展[4].

二、原癌基因及抑癌基因

基因突变主要是某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的改变，这些改变导致细胞的增殖分化和凋亡失调最终导致肿瘤的发生。

抑癌基因根据功能可分为控制细胞增生的看门基因( Gatekeeper gene) 和维持基因完整的看管基因( Caretaker gene) 。几乎一半的人类肿瘤均存在抑癌基因的失活，可见抑癌基因的失活与肿瘤的生长有着密切的关系。目前研究较多的常见抑癌基因包括P53、Rb、APC、DDC等。

肿瘤抑制基因P53是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，是目前研究最广泛和深入的抑癌基因。其正常功能的丧失，最主要的方式是基因突变。由于P53 基因点突变，直接的后果是导致氨基酸的改变，最终产生没有活性的P53 蛋白，失去抑癌作用。由于人类恶性肿瘤P53 基因突变率较高，P53 基因的研究及治疗肿瘤就自然成了研究的热点。推测突变型P53 基因蛋白致癌作用是通过抑制细胞凋亡来实现的。另外近年发现Bcl-2 可抑制各种组织的细胞凋亡，是目前公认的抗凋亡基因［5-6］。周建斌、李代强等应用原位末端标记及免疫组化技术检测肝母细胞瘤中细胞凋亡及增殖细胞核抗原( PCNA) ，P53 和Bcl-2 蛋白表达，通过与对照组对比研究，得出突变型P53 及Bc1- 2蛋白均具有抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用［7］。其他研究，胡友主通过过氧化物酶标记的链霉卵白素方法表面，抑凋亡基因Bcl-2 在

肝母细胞瘤及小儿正常肝组织中均无表达，P53 在肝母细胞瘤中表达阳性率为69． 2%，在小儿正常肝组织中无表达(P＜0.01);P53 的阳性表达水平，临床分期越晚则越高(P＜ 0.01); 胚胎型组高于胎儿型组［8］。证实肝母细胞瘤的发生与P53 蛋白异常表达有关，与Bc1-2 表

达无关。可以通过肝母细胞瘤测定P53表达判断预后。肝母细胞凋亡与增殖平衡调控异常在肝母瘤的发生、发展中可能起重要作用，突变型P53 及Bc1-2 蛋白均具有抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用。研究人员还发现P53 与增殖细胞核抗原( PCNA) 表达之间存在着一种正相关关系，都与肿瘤的预后等因素有关。针对上述研究引入P53 基因体内体外实验均表明确实可以抑制肿瘤细胞的生长，诱导其出现凋亡。将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞中，以补偿和代替突变或缺失的抑癌基因，达到抑制肿瘤的生长或逆转其表型的抑癌基因治疗。

RECK 基因是近年发现的新型基质金属蛋白酶( MMP) 抑制剂，研究表明，其可在转录后水平抑制多种MMP的表达，抑制肿瘤血管形成，从而抑制肿瘤的侵袭及转移。研究表明，在9 号染色体短臂上，特别是RECK 基因定位的9P13 ～ P12 区域上的基因［9-11］，与许多肿瘤的发生、发展密切相关，这些肿瘤包括肺癌、肝细胞癌、头颈部鳞状细胞癌和膀胱移行细胞癌等。基质金属蛋白酶( matrixmeta -lloproteinases，MMPs) 是自然界进化中高度保守的一类酶，其广泛分布于植物、脊椎动物、无脊椎动物中，MMP对ECM 的降解是肿瘤细胞侵袭和转移的关键环节之一，多种恶性肿瘤都伴有MMPs 分泌水平和活性的增高。在正常稳定状态下，组织中MMP 的表达量极少，而在炎性细胞因子、激素、生长因子刺激和细胞转化过程中其表达量明显升高。此过程涉及人体多种生理及病理过程，如炎症、胚胎发生、血管形成、肿瘤侵袭转移等。其中MMP 在肿瘤侵袭转移中作用机制的研究较多，有研究表明，在肿瘤组织中，其多种MMP 的表达均明显升高，MMP 与多种肿瘤侵袭转移的能力呈明显正相关。因此，关于MMP 及其抑制剂的研究方兴未艾。RECK 蛋白、膜型基质金属蛋白酶-1( MT1-MMP) 同样在肝母细胞瘤组织中的表达及其在肿瘤转移抑制中的作用。孙建等通过免疫组织化学方法检测35 例肝母细胞瘤组织和15 例正常肝脏组织及10 例肝脏良性肿瘤组织中RECK、MT1-MMP 的表达情况。结果发现肝母细胞瘤组织RECK 的表达水平明显降低，MT1-MMP 肝母细胞瘤组织中高表达，并随着肿瘤浸润深度的加深、远处转移的发生而增高；二者表达呈负相关。RECK 和MT1 - MMP 在肝母细胞瘤组织中的表达呈负相关；RECK 和MT1 - MMP 在肝母细胞瘤的进展中起重要作用。免疫组织化学方法检测35 例肝母细胞瘤组织和15 例正常肝脏组织及10 例肝脏良性肿瘤组织中RECK、MT1-MMP 的表达情况。结果：肝母细胞瘤组织RECK 的表达水平明显降低；MT1-MMP 肝母细胞瘤组织中高表达，并随着肿瘤浸润深度的加深、远处转移的发生而增高；二者表达呈负相关。表明RECK 在肝母细胞瘤组织中表达随着肿瘤浸润程度的增加而下调［12］。说明MT1 － MMP 在肝母细胞瘤组织中高表达，并随着肿瘤浸润和转移的

发生而增高。肝母细胞瘤组织中RECK 和MT1 － MMP 的表达呈负相关，RECK 蛋白的表达对肝母细胞瘤的侵袭转移可能有抑制作用，该作用可能与降低MTI－ MMP 蛋白的表达有关。

许多细胞癌基因实际上就是具有启动子特异性的转录因子, 通过与基因启动子区域的

特异序列结合的方式调节基因, 影响细胞生长、分化和凋亡。

C-myc是具有439个氨基酸的核蛋白,是人们发现较早的原癌基因之一,也是与人类肝脏

肿瘤最相关的基因。它属于具有DNA 结合功能的转录因子,在细胞增殖过程中起重要作用[13]。人类多肿瘤中发现C-myc 基因异常扩增, 被认为与肿瘤发生有关, 并把它作为肿瘤与非肿

瘤的标志及肿瘤分级、分期的敏感指标。PCNA 发现于1978年,是相对分子质量为36 000 的酸性蛋白,为DNA 合成不可缺少的因子,也是一种细胞周期调节蛋白, 其表达随细胞周期而

变化, 在G1 期开始上升,S期达高峰,PCNA 常作为测定细胞增殖水平的指标之一。PCNA 过度表达是肿瘤生长快、侵袭力强及病人预后差的指标。华尧楷等发现HB组织内C-myc 癌基因激活和异常扩增, 使肝细胞获得增殖和分裂优势, 这种组织学上细胞增殖分化异常, 不但与HB 的发生、发展有密切关系, 而且与肿瘤的临床分期和预后有关。此研究还显示PCNA阳性