辐射交联法制备胶原多孔支架材料

radioprotector. Free Radical.Biol.Med.2000, 28:953.

辐射交联法制备胶原多孔支架材料

张向梅1，2黄鑫2许零1，2*陈欣3翟茂林4魏世成1，5*

（1. 北京大学工学院，北京100871

2. 北京大学前沿交叉学科研究院生物医用材料与组织工程研究中心

3. 北京市积水潭医院烧伤整形科，北京100035

4.北京大学化学与分子工程学院，北京100871

5. 北京大学口腔医学院口腔颌面外科,北京100081）

摘要:采用辐射交联法制备胶原水凝胶,探索制备条件与水凝胶性能之间的关系，研究胶原水凝胶的机械性能与酶降解性能，通过大鼠体内植入评价其生物相容性。由胶原凝胶进一步制备多孔支架，在支架上培养成纤维细胞，通过MTT法评价材料的细胞毒性及其促进成纤维细胞增殖的能力。结果表明辐射交联有效提高了胶原的机械强度和抗酶降解能力，胶原凝胶的生物相容性好，多孔支架可有效促进成纤维细胞生长。本研究为胶原凝胶作为皮肤支架材料奠定了基础。

关键词：胶原凝胶；辐射交联；生物降解；多孔支架

前言

胶原是细胞外基质的主要成分,在创伤愈合中扮演着重要角色1。但胶原力学性能较差、降解速率过快，在实际应用中受到限制，需要通过交联来改善相关性能2。交联主要分为化学交联法和物理交联法。常用的化学交联剂有戊二醛（GTA）3、1-乙基-3（3-二氨基丙基）碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺（EDC/NHS）4、二苯基磷酰叠氮化物（DPPA）5、环己二异氰酸酯(HMDIC)6等。这些化学合成的交联剂具有很高或相对较高的细胞毒性，导致了使用它们进行交联处理的胶原材料存在不同程度的试剂残留问题。物理交联法有热交联（DHT）7、重度脱水8和紫外9、γ射线10-11、电子束辐射12-13交联等方法，物理交联法可避免外源性有毒化学物质进入胶原内，与化学交联法相比在很大程度上降低了细胞毒性。因为胶原变性温度低，作为生物材料，其灭菌工艺也受到很大限制。辐照交联可使交联和灭菌一步完成，避免了后灭菌带来的影响。

胶原是目前国际上几种人工真皮产品的主要成分。已上市的人工皮肤Apligraf®、Integra®、Alloderm®其主要成分都是胶原。进口真皮支架的价格并不是所有病人都能够承受，尤其是大面积皮肤缺损的病人。因此，开发一种价格低廉，又能够满足生物学和临床要求的真皮支架产品十分重要。

我们采用辐照交联法制备胶原多孔材料以期作为真皮支架。真皮支架必须具有良好的力学性能和生物相容性，在移植到创面后应能被机体逐渐降解吸收，与受体真皮组织的再生相协调。因此，对胶原多孔支架的力学性能、降解和生物相容性的研究十分必要。

1 材料与方法

1.1 辐照实验

胶原与超纯水以一定比例混合均匀后装入玻璃试管，去除气泡并封口。用60Co-γ射线以20Gy/min 的辐射剂量率辐射不同吸收剂量。

1.2 胶原凝胶机械性能

重大科学研究计划（2007CB936103），北京大学交叉与新兴学科研究基金资助。

*通讯作者：许零，lingxu@；魏世成；sc-wei@。

将圆柱体胶原凝胶(直径约7mm,高约5mm)用Instron5843材料试验机以1mm/min 对其进行压缩测试，用得到的应力-应变曲线初始的直线部分（应变0-0.2）进行线性拟合，直线斜率定为压缩模量。

1.3 体外酶降解

将圆柱体胶原凝胶（直径约7mm,高约10mm ）称重后加入新鲜配制的浓度为0.1mg/ml 的胶原酶PBS 溶液，放入37℃恒温培养箱，于预定时间取出胶原凝胶停止反应，37℃烘干后称重。按式（1）计算质量损失率。

1100%=−××干胶质量质量损失率原湿胶质量固含量

（1） 1.4 体外细胞共培养

将圆柱体胶原凝胶(直径约7mm,高约3mm)冷冻干燥得到胶原多孔支架，待支架被培养基完全浸润，将生长状态良好的处于对数生长期的成纤维细胞种植在支架上，37℃孵育两天。用MTT 法检测细胞活性。按式（2）计算相对增殖率。

RGR 100%=×材料组吸光度空白组吸光度

（2） 1.5 体内植入

将胶原凝胶移植到大鼠皮下，两周后处死，观察材料降解情况及其与组织的相容性。

2 结果讨论

2.1 辐射交联

用γ射线辐射实现胶原的交联。实验所用胶原浓度及辐照剂量均得到了胶原凝胶，说明胶原发生了交联反应。实验结果（如图1）表明相同辐照剂量，随体系中胶原含量的增多，交联部分比例增大。体系中胶原含量相同，随辐照剂量增大，交联部分比例减小。胶原浓度和辐照剂量对交联的影响很大，提高胶原浓度和减小辐照剂量有利于交联。

图1.辐照剂量与胶原水凝胶质量分数的关系。1-胶原与水的质量比为100/0;2-胶原与水的

质量比为100/100;3-胶原与水的质量比为17/100.

图2 胶原凝胶的压缩模量

2.2 机械强度

胶原凝胶用做人工真皮，其上还要覆盖一层表皮，主要受到压应力。因此对胶原凝胶进行了压缩测试。不同辐照剂量的胶原凝胶测得的压缩模量稍有差异，总体来说压缩模量随辐照剂量增大呈上升趋势（如图2）。说明辐照剂量对压缩强度有一定的影响。皮肤的弹性模量测定值范围从0.02MPa 到约100MPa，主要取决于推导材料参数所用的模型和所施加的应力14。胶原凝胶的压缩模量均在皮肤弹性模量范围内。若将其用于皮肤组织修复，其机械性能与皮肤匹配。

图3 胶原凝胶的体外酶降解

2.3 体外酶降解

胶原纤维由于广泛的共价交联，其结构稳定，体内有特异作用于胶原的胶原酶(Collagenase)，对其分解起关键作用。因此要求植入体内的胶原材料具有一定的降解期，研究胶原蛋白的降解特性具有重要意义。实验表明在0.1 mg/ml胶原酶的PBS溶液中，胶原凝胶质量损失随时间的延长而增加，而且呈现出一定的辐照剂量相关性（如图3）。在实验条件下，辐照剂量为5kGy的胶原凝胶4h质量损失率已达到100%，而辐照剂量从10kGy、15kGy、20kGy、25kGy的胶原凝胶4h的质量损失率分别为94%、74%、54%、37%。随辐照剂量增大，胶原凝胶降解速率减慢，因此，交联提高了胶原的抗酶降解能力，胶原凝胶的降解速率可通过交联程度控制。

2.4 体外细胞共培养