一氧化氮的检测
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以光学信号强度(荧光或化学发光强度)作为NO定 量的指标，能够快速、准确、实时的反映一氧化氮含 量的变化。
光学传感器
--光学生物传感器
Sato等设计了NO的生物传感器—NOA-I。
首先在cGMPase上连接荧光探针，该探针由环磷酸鸟苷 依赖的蛋白激酶 ,黄色荧光蛋白和青色荧光蛋白组成。血 管内皮细胞转染该传感器后，细胞内的NO与NOA-1结合 产生的cGMP，激活产生荧光共振能量转移(FRET)信号， 检测到该细胞产生了1nmol·L - 1的NO。
评价：特异性高、操作简单、稳定 NO 与N-乙酰半胱氨酸的反应特异性高,保
证了测定的特异性,最低可测定10 - 8 mol·L - 1 水平
硫酸奎宁是一种非常稳定的荧光物质, 脑匀 浆的浓度对硫酸奎宁的荧光强度几乎无影响。
采用以荧光强度的变化来计算NO 的产生量, 消除了体系中各物质对荧光强度的背景作用。
仪器：岛津UV-260 紫外分光光度计 岛津RF-5000 荧光光度计
荧光分析法
1、NACNO的制备及波峰扫描 2、观察NACNO 对硫酸奎宁的内滤过效应 3、NO 的标准曲线（以NACNO的浓度为横坐
标，荧光强度为纵坐标） 4、脑组织NO 的测定（制作脑匀浆）
根据NO 的标准曲线计算NO 的量
荧光分析法
荧光分析法
原理：
NO +N-乙酰半胱氨酸(NAC)
硝基N-乙酰半胱氨酸(NACNO)
NACNO在334 nm 有一吸收峰, 波长范围与硫酸喹啉（荧光物质） 的激发波长相重叠。
NACNO起到内滤过效应,与硫酸奎宁“竞争性”吸收334 nm
波长的能量,使硫酸奎宁的荧光强度减弱,由NO 生成的NACNO 越 多,内滤过效应越强。
是公认的直接测定NO的方法
电化学传感器
Barbosa等用碳纤维微电极实时检测麻醉大鼠 脑部NO的变化。
1、在碳纤维电极表面修饰全氟磺酸离子交换膜 和邻苯二胺膜，选择性透过NO，阻止阴离子 和大分子物质(如抗坏血酸、DA、NA等)透过。
2、将微电极与微量吸管黏结后，立体定位插入 大鼠脑部，测定N-甲基-D-天门冬氨酸激活大 脑海马组织NOS产生的NO。
化学发光法--Fra Baidu bibliotek米诺法
原理：利用过氧化氢氧化NO生成的过亚硝酸根 激发化学发光试剂鲁米诺，激发态的鲁米诺回 到基态时会发出光学信号，以化学发光强度作 为一氧化氮的定量指标。
东京大学的一个课题组曾将鲁米诺-过氧 化氢化学发光法与微透析技术结合用于实时测 定活体大鼠脑部的一氧化氮，检测限可达 1nmol-1。
参与一些神经退行性疾病的发生发展
一氧化氮的性质
易逸性、不稳定性
NO是无色气体，含一对未配对电子的自由基， 十分活跃不安定，生命周期很短，半衰期约3-5秒， 只活跃10秒就会氧化成亚硝酸盐(NO 2－)和硝酸盐 (NO 3－)
检测方法
荧光分析法 化学发光法--鲁米诺法 电化学传感器 光学传感器 --光学生物传感器
化学发光法--鲁米诺法
评价： 反应灵敏度较高，响应时间短。 鲁米诺可以与多种物质发生氧化反应， 方法的选择性和专属性受到影响。 鲁米诺法与微透析等取样技术联用，虽 然可以提高反应的选择性，却会造成测 定时间延长，灵敏度下降等问题。
电化学传感器
原理：利用NO的氧化还原性，使其在电极上释 放电子最终被氧化为硝酸根离子，由反应发生 时电化学信号的变化来反映含量。
阿片肽，其他 神经肽
5 其他神经递质
NO，前列腺素，组胺， 嘌呤类
一氧化氮的产生
血管内皮细胞和神经细胞是NO的生成细胞。 NO的生成由一氧化氮合酶（NOS）催化，以
L-精氨酸为底物，以NADPH作为电子供体， 生成NO和L-瓜氨酸。
亚硝酸盐的还原也是体内部分组织生成一氧化 氮的一种方式。
电化学传感器
评价：实现了原位活体检测NO的目标
检测限可达nmol级，快速、准确、灵敏度高、 仪器简便和成本较低，可以研究NO在生物体 内的代谢动力学。
光学传感器 --光学生物传感器
原理：NO可以和生物体内的cGMPase中的亚铁血红素 发生特异性结合，激活cGMPase,将GTP转变为 cGMP，进而由cGMP激活cGMP依赖的蛋白激酶， 引发下游的信号级联反应，产生生物学效应。
该小组随后又成功制备了NO生物传感器--Piccell细胞株。
稳定表达特异性检测cGMP的荧光探针，利用探针产生的 FRET信号考察神经元细胞释放NO的动力学过程，检测限 低达20 pmol·L - 1 。
光学传感器 --光学生物传感器
评价
优点：检测灵敏度和特异性高，可逆性和重现性， 适于进行细胞动力学研究；
脑内神经递质的检测 ——一氧化氮
脑内神经递质的类型
1 胆碱类
乙酰胆碱
2 单胺类
(1)儿茶酚胺
a 去甲肾上腺素
b 多巴胺
c 肾上腺素
(2) 吲哚胺
5-羟色胺
3 氨基酸类
(1) 抑制性氨基酸类：γ-氨基丁酸，甘氨酸
（2） 兴奋性氨基酸类：谷氨酸，天冬氨酸
4 多肽类，神经肽类
所以，测定硫酸奎宁荧光强度的改变,可反映NO 的量。
注意：脑内产生的NO 经代谢后主要以较为稳定的亚硝酸盐或硝酸盐 的形式存在,在酸性条件下,亚硝酸盐形成的亚硝酸不稳定,可释放出 NO。因此,NO 的测定需在酸性条件下。
荧光分析法
试剂：N-乙酰半胱氨酸,硫酸奎宁（分析纯） 亚硝酸钠，HCl 和磷酸盐缓冲液(pH 7.4)
谢谢！
一氧化氮在神经系统中的作用
生理功能：低浓度时，信息传递。参与学习、记忆， 并且具有调节脑血流的作用。 在中枢神经系统突触后神经末梢,谷氨酸等兴奋性氨 基酸通过N-甲基-D-天冬氨酸受体引发钙离子内流, 激 活cNOS产生NO,继而通过cGMP等途径传递信号。
神经毒性：高浓度时，脑缺血诱导表达iNOS,生成大 量NO, 损伤神经系统。
缺点：制备过程繁琐，需要专业技术人员才能完 成，受到了一定程度的限制。
前景与展望
多种NO分析方法已经被建立并逐步应用于体 外NO水溶液、活细胞和组织成像以及原位活 体NO检测，灵敏度可达到纳摩尔级甚至更低 水平，方法选择性和准确度也有显著提高，发 展速度不容忽视。
NO定量方法学和分析技术还有待于深入探索 和研究，现有方法还不能完全准确地测定体内 NO的含量及其释放动力学过程。
光学传感器
--光学生物传感器
Sato等设计了NO的生物传感器—NOA-I。
首先在cGMPase上连接荧光探针，该探针由环磷酸鸟苷 依赖的蛋白激酶 ,黄色荧光蛋白和青色荧光蛋白组成。血 管内皮细胞转染该传感器后，细胞内的NO与NOA-1结合 产生的cGMP，激活产生荧光共振能量转移(FRET)信号， 检测到该细胞产生了1nmol·L - 1的NO。
评价：特异性高、操作简单、稳定 NO 与N-乙酰半胱氨酸的反应特异性高,保
证了测定的特异性,最低可测定10 - 8 mol·L - 1 水平
硫酸奎宁是一种非常稳定的荧光物质, 脑匀 浆的浓度对硫酸奎宁的荧光强度几乎无影响。
采用以荧光强度的变化来计算NO 的产生量, 消除了体系中各物质对荧光强度的背景作用。
仪器：岛津UV-260 紫外分光光度计 岛津RF-5000 荧光光度计
荧光分析法
1、NACNO的制备及波峰扫描 2、观察NACNO 对硫酸奎宁的内滤过效应 3、NO 的标准曲线（以NACNO的浓度为横坐
标，荧光强度为纵坐标） 4、脑组织NO 的测定（制作脑匀浆）
根据NO 的标准曲线计算NO 的量
荧光分析法
荧光分析法
原理：
NO +N-乙酰半胱氨酸(NAC)
硝基N-乙酰半胱氨酸(NACNO)
NACNO在334 nm 有一吸收峰, 波长范围与硫酸喹啉（荧光物质） 的激发波长相重叠。
NACNO起到内滤过效应,与硫酸奎宁“竞争性”吸收334 nm
波长的能量,使硫酸奎宁的荧光强度减弱,由NO 生成的NACNO 越 多,内滤过效应越强。
是公认的直接测定NO的方法
电化学传感器
Barbosa等用碳纤维微电极实时检测麻醉大鼠 脑部NO的变化。
1、在碳纤维电极表面修饰全氟磺酸离子交换膜 和邻苯二胺膜，选择性透过NO，阻止阴离子 和大分子物质(如抗坏血酸、DA、NA等)透过。
2、将微电极与微量吸管黏结后，立体定位插入 大鼠脑部，测定N-甲基-D-天门冬氨酸激活大 脑海马组织NOS产生的NO。
化学发光法--Fra Baidu bibliotek米诺法
原理：利用过氧化氢氧化NO生成的过亚硝酸根 激发化学发光试剂鲁米诺，激发态的鲁米诺回 到基态时会发出光学信号，以化学发光强度作 为一氧化氮的定量指标。
东京大学的一个课题组曾将鲁米诺-过氧 化氢化学发光法与微透析技术结合用于实时测 定活体大鼠脑部的一氧化氮，检测限可达 1nmol-1。
参与一些神经退行性疾病的发生发展
一氧化氮的性质
易逸性、不稳定性
NO是无色气体，含一对未配对电子的自由基， 十分活跃不安定，生命周期很短，半衰期约3-5秒， 只活跃10秒就会氧化成亚硝酸盐(NO 2－)和硝酸盐 (NO 3－)
检测方法
荧光分析法 化学发光法--鲁米诺法 电化学传感器 光学传感器 --光学生物传感器
化学发光法--鲁米诺法
评价： 反应灵敏度较高，响应时间短。 鲁米诺可以与多种物质发生氧化反应， 方法的选择性和专属性受到影响。 鲁米诺法与微透析等取样技术联用，虽 然可以提高反应的选择性，却会造成测 定时间延长，灵敏度下降等问题。
电化学传感器
原理：利用NO的氧化还原性，使其在电极上释 放电子最终被氧化为硝酸根离子，由反应发生 时电化学信号的变化来反映含量。
阿片肽，其他 神经肽
5 其他神经递质
NO，前列腺素，组胺， 嘌呤类
一氧化氮的产生
血管内皮细胞和神经细胞是NO的生成细胞。 NO的生成由一氧化氮合酶（NOS）催化，以
L-精氨酸为底物，以NADPH作为电子供体， 生成NO和L-瓜氨酸。
亚硝酸盐的还原也是体内部分组织生成一氧化 氮的一种方式。
电化学传感器
评价：实现了原位活体检测NO的目标
检测限可达nmol级，快速、准确、灵敏度高、 仪器简便和成本较低，可以研究NO在生物体 内的代谢动力学。
光学传感器 --光学生物传感器
原理：NO可以和生物体内的cGMPase中的亚铁血红素 发生特异性结合，激活cGMPase,将GTP转变为 cGMP，进而由cGMP激活cGMP依赖的蛋白激酶， 引发下游的信号级联反应，产生生物学效应。
该小组随后又成功制备了NO生物传感器--Piccell细胞株。
稳定表达特异性检测cGMP的荧光探针，利用探针产生的 FRET信号考察神经元细胞释放NO的动力学过程，检测限 低达20 pmol·L - 1 。
光学传感器 --光学生物传感器
评价
优点：检测灵敏度和特异性高，可逆性和重现性， 适于进行细胞动力学研究；
脑内神经递质的检测 ——一氧化氮
脑内神经递质的类型
1 胆碱类
乙酰胆碱
2 单胺类
(1)儿茶酚胺
a 去甲肾上腺素
b 多巴胺
c 肾上腺素
(2) 吲哚胺
5-羟色胺
3 氨基酸类
(1) 抑制性氨基酸类：γ-氨基丁酸，甘氨酸
（2） 兴奋性氨基酸类：谷氨酸，天冬氨酸
4 多肽类，神经肽类
所以，测定硫酸奎宁荧光强度的改变,可反映NO 的量。
注意：脑内产生的NO 经代谢后主要以较为稳定的亚硝酸盐或硝酸盐 的形式存在,在酸性条件下,亚硝酸盐形成的亚硝酸不稳定,可释放出 NO。因此,NO 的测定需在酸性条件下。
荧光分析法
试剂：N-乙酰半胱氨酸,硫酸奎宁（分析纯） 亚硝酸钠，HCl 和磷酸盐缓冲液(pH 7.4)
谢谢！
一氧化氮在神经系统中的作用
生理功能：低浓度时，信息传递。参与学习、记忆， 并且具有调节脑血流的作用。 在中枢神经系统突触后神经末梢,谷氨酸等兴奋性氨 基酸通过N-甲基-D-天冬氨酸受体引发钙离子内流, 激 活cNOS产生NO,继而通过cGMP等途径传递信号。
神经毒性：高浓度时，脑缺血诱导表达iNOS,生成大 量NO, 损伤神经系统。
缺点：制备过程繁琐，需要专业技术人员才能完 成，受到了一定程度的限制。
前景与展望
多种NO分析方法已经被建立并逐步应用于体 外NO水溶液、活细胞和组织成像以及原位活 体NO检测，灵敏度可达到纳摩尔级甚至更低 水平，方法选择性和准确度也有显著提高，发 展速度不容忽视。
NO定量方法学和分析技术还有待于深入探索 和研究，现有方法还不能完全准确地测定体内 NO的含量及其释放动力学过程。