乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析

乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析

【摘要】目的：克隆并分析保加利亚德氏乳杆菌中的乳糖酶基因。方法：利用PCR技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出乳糖酶基因、测序并生物信息学分析。结果：成功的从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3 024 bp的乳糖酶基因，利用生物软件分析，推测乳糖酶基因共编码1 008个氨基酸，蛋白分子量为114 KDa，等电点为4.9，氨基酸序列中共有9处潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。结论：成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征，为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。

【关键词】乳糖酶基因；克隆；生物信息学分析

Clone and bioinformatics analysis of lactase gene

WANG Zheng1, 2, MA Wen li1, ZHENG Wen ling1

(1.Institute of Gene Project, South Medical University Guangzhou 510510, China;

2.Key Laboratory of Molecular Biology, Hainan Medical College Haikou 571101, China )

［ABSTRACT］Objective: To clone and analyze lactase gene from Lactobacillus delbrueckii bulgaricus. Methods: Cloned lactase gene from Lactobacillus delbrueckii bulgaricus with PCR, made sequencing and bioinformatics analysis. Results: Cloned lactase gene (3 024 bp) successfully. It was presumed that the lactase gene encode 1 008 amino acids, with protein molecule 114 KDa, isoelectric point 4.9, 9 potential glycosylation sites in amino acid sequence. Made homology comparison with other lacteses. Conclusion: The lactase gene is cloned successfully and the bioinformatics analysis is made by biological analysis software to investigate its character. It provides foundation for further study and colonization at low cost.

［KEY WORDS］Lactase gene; Clone; Bioinformatics analysis

乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，还含有免疫球蛋白等抗病因子，易被人体消化吸收，是人类改善营养、增强体质的理想食品［1］。除此之外，在牛乳等制品当中还含有5%左右的乳糖,它是牛奶中主要的碳水化合物，对人体有着重要的作用。主要表现在于乳糖能促进钙质吸收及整理肠道的功效，特别是乳糖被分解后的半乳糖是婴儿脑发育的必需物质，与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。然而，人体却不能直接利用乳糖，它必须被乳糖酶分解为单糖的葡萄糖及半乳糖后才能被吸收和利用。据研究发现，世界各国人口都有不同程度的乳糖酶缺乏，东方人乳糖酶缺乏高达85%［2］，从而导致“乳糖不耐症”的发生。

乳糖酶(EC3．2．1．23，又名β 半乳糖苷酶)能将牛乳中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，并具有半乳糖苷的转移作用［3］。利用该酶生产低乳糖制品或口服酶制剂，能够有效解决“乳糖不耐症”问题。乳糖酶广泛存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡豆等植物中，大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉菌等微生物中，以及有效哺乳动物的小肠等器官和皮肤组织中。然而，

不同来源的乳糖酶，其酶学性质相差很大。本研究从保加利亚德氏乳杆菌中成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征，为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒保加利亚德氏乳杆菌购买于广东省微生物研究所菌种保藏中心；大

肠杆菌DH5α由本室保存；pGM T vector购于北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 试剂材料细菌培养试剂购于Sigma公司；引物由上海生工合成；LA DNA聚合酶购于自大连宝生物公司；细菌基因组提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、小量质粒提取试

剂盒、DNA Ladder购于北京天根生化科技有限公司；T4连接酶、琼脂糖、荧光染料由本

室保存。

1.2 方法

1.2.1 保加利亚德氏乳杆菌基因组DNA的提取

用灭菌双蒸水溶解干冻管里的保加利亚德氏乳杆菌，并划平板到MRS固体培养基，37 ℃培养72 h，挑取单个菌落于MRS液体培养基进行增菌（37 ℃摇床）。利用细菌基因组提取试剂盒提取保加利亚德氏乳杆菌基因组DNA，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度。

1.2.2 引物设计与合成从GenBank数据库中检索到保加利亚德氏乳杆菌中乳糖酶基因序列（GenBank序列号：GI149564）设计引物如下：P1：5' 5' CGCGGATCCGCGATG AGC AA TAAGTTA 3'；P2：5' CCGCTCGAGCGGTTATTTTAGTAAAAGGG 3'

。上

述引物由大连宝生物工程有限公司合成(下划线碱基分别为BamH I和Xho I酶切位点)。

1.2.3 乳糖酶基因的PCR扩增与鉴定反应总体积为25 μL：模板DNA(1 μg/μL) 3 μL，10×buffer2.5 μL,Mg2+( 25 mM)2.0 μL, dNTP(2．5 mM)2.5 μL,引物P1(10 pmol／μL) 0.4 μL,引物P2 (10 pmol／μL)0.4 μL,LA DNA聚合酶(5 U/uL)0.2 μL,双蒸水14 μL；反应条件：98 ℃，1 min;94 ℃,30 sec;50 ℃,30 sec;72 ℃,4 min; 30个循环；72 ℃，5 min.然后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，同时加上500 bp Ladder对PCR产物进行初步鉴定。

1.2.4 乳糖酶基因的克隆与鉴定PCR扩增出目的基因，1%琼脂糖电泳，切胶后用DNA 胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化的PCR产物与pGM T vector进行连接（4 ℃，24 h），转入新制备［4］的感受态大肠杆菌DH5α，再涂于含氨苄青霉素的LB培养基上37 ℃培养过夜，用接种针分别挑取仅有的4个菌落于含氨苄青霉素的LB液体培养基上增菌培养（做好标记）。采用小量质粒提取试剂盒分别对4管菌液提取质粒。采用三酶切(BamH I、Xho I 和Pvu I)和PCR两种方法对重组子进行鉴定。经鉴定的阳性重组质粒由北京天根生化科技有限公司测序。

1.2.5 乳糖酶基因序列的生物信息学分析利用生物软件DNAssist Version2.0对该序列进行物理化学性质的分析，推测其氨基酸序列。利用在线分析软件SOPMA对其进行二级