基因工程实验报告

基因工程
实
验
报
告
甘薯ADK基因反义载体的构建
（西南大学生命科学学院，重庆400715）
摘要：以甘薯为材料，提取甘薯的基因组DNA，以其基因组DNA为模板在体外克窿甘薯ADK基因核心片段并电泳检测基因的纯度。

利用含有pHB载体质粒的大肠杆菌提取pHB质粒。

将PHB质粒和ADK基因片段进行双酶切，构建ADK基因反义载体，检验是否构建成功，最后转入大肠杆菌中检验观察是否转入成功。

关键词：甘薯；腺苷酸激酶基因（adk）；反义载体；PCR
英文摘要：
1.综述
1.1甘薯
甘薯(Ipomoea batatas (L. ) Lam.)属旋花科(Convolvulaceae)甘薯属((Ipomoea)蔓生一年生草本植物，染色体数为2n=6x=90。

在我国因各地语言差异，甘薯的中文俗名较多，又名番薯、白薯、地瓜、山芋、红芋、红苔、红薯等[u1，其英文一般写作sweet potato，在美国也有写为sweetpotato[27. 1989年美国甘薯合作者组织规定用Sweetpotato表示甘薯，以便更准确地表达甘薯的特性及与Potato(马铃薯)相区别[37。

目前，此表达方式已在美国、澳大利亚等许多英语国家采用，并逐步被其他国家或地区的甘薯研究者所接受〔引。

目前学术界一致公认甘薯起源于热带美洲，经“Kumara"路线、"Batata"路线、"Kamote"路线传播到世界各地〔.5J，由于甘薯具有耐旱、耐痔，繁殖力强、适应性广、栽培简便、产量高，用途广泛等特点，现已在全世界广泛栽培。

我国的甘薯栽培己有400多年的历史。

据史料记载，甘薯于16世纪的1563-1594年间，经陆海多种渠道传入我国。

在我国，甘薯的栽培分布很广，南起海南诸岛，北至内蒙古，西北达陕西、陇南和新疆一带，东北经辽宁、吉林延展到黑龙江南部，西南抵藏南和云贵高原。

‘四川盆地、黄淮海、长江流域和东南沿海各省是我国甘薯的主
产区
1．2 ADK基因
腺昔酸激酶(EC.2.7.4.3, adenylate kinase, ADK)催化ATP和AMP合成两分子ADP的可逆反应，是调控这三种前体分子在淀粉代谢库和核酸代谢库中分配的关键酶。

IbADK全长1314bp，其编码区长度为855bp，编码长度为284个氨基酸残基的ADK蛋白(IbADK)；生物信息学预测IbADK分子量为30.86kDa，等电点为6.46。

1.3 反义载体
将目的基因与载体用相同限制性内切酶酶切后，将目的片段反向插入载体中，可以起到基因沉默的目了，构建过程主要是酶切，连接检测，最后测序确定。

1.4质粒（Plasmid）
是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，他具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。

2．材料与方法
2.1材料
2.1.1大肠杆菌：含PHB载体质粒的大肠杆菌；含PMD-T-aIb ADK质粒的大肠杆菌；大肠杆菌DH5α菌株。

2.1.2仪器
PCR扩增仪，PCR用薄壁管，电泳仪，恒温水浴锅，THZ-C水平摇床1台，冷冻离心机1台，涡旋仪1台，超净工作台1台，移液枪1套，锥形瓶若干，培养皿2套，室内使用的大中型枪头各2盒，浮标1个，室内使用的1.5mL的EP管若干，涂棒1根，凝胶成像系统1台，恒温培养箱1台，一次性PE手套，计时器1个，药勺若干。

2.1.3试剂
氨苄青霉素，AP/Amp：溶于无菌水，0.22μm滤膜过滤。

卡那霉素，km/Kan：溶于无菌水，0.22μm滤膜过滤。

TIANGEN质粒小提试剂盒（离心柱型）；BamHΙ、XbalΙ（Fermentas公司）；ddH2O；TIANGEN 普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）；DNAligation连接试剂盒；CaCl21瓶；常规PCR试剂1套；上游引物FaADK；下游引物RaADK；TBE缓冲液；回收级琼脂糖；溴化乙锭；Taq DNA聚合酶；10×PCR buffer；MgCl2；dNTP；marker（DL2000、λDNA/HindⅢ
各1支）。

2.1.4培养基
LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，灭菌后4℃保存。

LB琼脂平板（400ml、800ml）：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，pH7.0，灭菌后冷至60℃左右铺平板，视具体需要加相应抗生素做成Amp（50mg/L）或Kan （50mg/L）等平板。

2.2方法
2.2.1常用试剂及培养基的配制
配制LB液体培养基和LB琼脂平板。

2.2.2 质粒DNA的提取、纯化、电泳检验及酶切
1、将含有pHB载体质粒的大肠杆菌和含有PMD-T-aIb ADK质粒的大肠杆菌接种在加相应抗生素（Kan、Amp）的L B液体培养基中摇菌培养至合适浓度后采用质粒提取（小量）试剂盒（TIANGEN）抽提质粒。

具体方法与步骤见试剂盒说明。

2、抽提的质粒DNA用琼脂糖凝胶电泳检测、并拍照。

3、对提取的PHB载体质粒和PMD-T-aIb ADK质粒进行BamHⅠ、XbalⅠ双酶切鉴定。

酶切反应体系为：
去离子水23µL
10×K buffer 5µL
质粒(PHB/ PMD-T-aIb ADK) 20µL
BamHⅠ1µL
XbalⅠ1µL
总体积50 µL
短暂离心混匀后，于37 C水浴过夜反应。

反应结束后加入5µL的10×Loading Buffer 停止反应，再进行琼脂糖凝胶电泳检测、照相。

2.2.3酶切片段的回收与表达载体的连接反应
1．目的片段的回收纯化
将质粒pMD-T+aIb ADK进行BamH I＋Xba I完全双酶切后，电泳表明均切下一条0.85 kb 左右的目的条带(aIb ADK，为855-bp)。

回收aIb ADK，同时对pHB进行BamH I+Xba I完全双酶切，酶切产生两个分子量差异极大的片段，小片段是多克隆位点，大约几十bp，电泳根本无法看到；大片段就是pHB载体骨架(约12 kb)。

回收该大片段。

对酶切后目的基因片段aIb ADK（小片段）和pHB载体骨架(大片段)进行切胶回收。

采用胶回收（小量）试剂盒（TIANGEN）进行。

操作步骤见试剂盒说明。

2. 回收目的基因aIb ADK小片段与pHB大片段载体骨架的连接
连接体系：
在200 µL Eppendorf管中加入下列组分：
pHB大片段 1.5µl
aIb ADK小片段 3.5µl
Solution I 5µl
总体积10µl
连接条件：混匀，于16︒C过夜连接。

2.2.4大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备
大肠杆菌DH5α感受态的制备（CaCl2法）
1）将大肠杆菌DH5α接种于20ml LB液体培养基，37℃振荡（220rpm左右）过夜（12h 左右）培养（至对数生长期）；
2）将2 ml 过夜培养的菌液移入100ml LB培养基（一般为1:50的比例）中，37℃振荡培养至OD600为0.5-0.6，放于冰上30min；
3）取1ml菌液于1.5ml无菌eppendorf管中，4℃，4000rpm离心10min，去上清；4）沉淀用1ml预冷的0.1M CaCl2悬浮，用枪头轻轻吹打混匀，于冰上放置30min；
5）4℃，4000rpm离心10min，去上清，沉淀再加200μl 的0.1M CaCl2重悬，冰上放置2-7h 后，用于转化；或每管加20-30%的灭菌甘油，混匀，－70℃保存。

4）注意：新制成的感受态细胞在0℃放置12-24h这段时期内的转化效率较高
5）
2.2.5重组质粒的转化、筛选及PCR检测鉴定
1、重组质粒的转化、筛选
1）取上述方法制备的DH5α感受态细胞，或从－70℃冰箱中取出一管感受态细胞，融化；按每200 μl 菌液加100ng 已纯化的质粒DNA（无菌操作）的标准，将5-10μl DNA的连接物加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30分种；
注意：同时做两个对照组即受体菌对照组和质粒DNA对照组（检测感受态细胞的质量和有无污染情况）；
2)42℃水浴中热激恰恰90sec，迅速取出立即放于冰上2min，室温下放置3-5min；
注意：在水浴中切勿乱晃动
3）上述各管中分别加入800 μl 37℃预热的LB液体培养基至总体积为1ml，混匀后37℃180 rpm培养1-2h左右至菌复苏（并使转化体产生抗性）；
4）4000 rpm离心10min，去800 μl 上清液，将剩余的200 μl 菌液混匀；
5）用烧烤过的涂布棒将100μl的菌液涂布于加相应抗生素(Kan)的LB固体培养基涂匀，晾于超净台上1h左右至菌液完全被培养基吸收；
注意：涂平板时，一定要等烧烤过的玻棒冷却后再涂布，否则会烫死细菌；另外，以上步骤应无菌操作，防止污染
6）7℃倒置培养12-14h。

从平板上用无菌牙签挑取抗性菌落培养，PCR鉴定后（可同目的基因的克隆）再抽提质粒进行酶切验证。

2、PCR检测鉴定
以挑取的单菌落菌液为模板，用反义引物：FaADK，RaADK进行PCR扩增目的基因。

反应体系如下：
灭菌蒸馏水18.25μL
10×PCR buffer 2.5μL
MgCl2 1.5μL
dNTP 0.5μL
上游引物FaADK 0.5μL
下游引物RaADK 0.5μL
菌液模板1μL
Taq酶0.25μL
总体积共25μL
反应条件如下：
94℃6min （时间根据模板来确定）
94℃45sec
60℃45sec（退火温度和时间根据引物来确定）30个循环
72℃1min（时间根据扩增片段长度来确定）
72℃8min
反应完成后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果
2.2.6表达载体的酶切鉴定
工程菌的活化：
配制液体LB培养基（含有相应抗生素,Kan），50ml培养基中接种100ul的携带aIb ADK的PHB载体质粒的DH5 ，180rpm，37℃培养6h，即可获得经扩大培养的菌液；
制备质粒DNA（天根提取试剂盒）：
采用质粒小量提取试剂盒（天根提取试剂盒）抽提表达载体质粒（PHB-aIb ADK）。

具体操作步骤见（天根提取试剂盒）说明书。

酶切反应
1．混合以下溶液于一个无菌离心管中（酶切反应体系）：
去离子水13µL
10×K buffer 5µL
载体质粒PHB-aIb ADK (0.1-4ug) 30µL
BamHⅠ1µL
XbalⅠ1µL
总体积共50 µL
2. 混匀，在推荐温度下（一般为37℃，不同的酶及缓冲体系温度和时间可能发生变化）
保温2h，
3．然后琼脂糖凝胶电泳检测，并拍照。

3.实验结果与分析
3.实验结果与分析
3.1质粒DNA的提取
图3.1 抽提的质粒DNA电泳图
M1：DNA分子量标准DL2000(TaKaRa)，从上到下大小分别为2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
M2：DNA分子量标准λHin dIII (TaKaRa)，从上到下大小分别为23130 bp，9416 bp，6557 bp，4361 bp，2322 bp，2027 bp，564 bp，125 bp
泳道1、2、3：pHB质粒
泳道4、5、6：PMD-T-aIb ADK质粒
分析：
（1）．我们小组的条带为第3条与第6条带，从图中可以看出条带明显，亮度高，说明提取的DNA含量高。

（2）.我们组能得到明显亮带，证明我们在提取的过程中菌量适宜，操作规范，反应条件控制得当。

3.2双酶切鉴定
图3.2 PHB载体质粒和PMD-T-aIb ADK质粒
进行BamHⅠ、XbalⅠ双酶切后电泳图
M1：DNA分子量标准DL2000(TaKaRa)
M2：DNA分子量标准λHin dIII (TaKaRa)
泳道1、2、3：pHB被Bam HI+Xba I完全双酶切的电泳结果
泳道4、5、6：pMD-T-aIbADK被Bam HI+Xba I完全双酶切的电泳结果
分析：
图中第3条和第6条带是本组的实验结果，从图中可以看出本组的目的条带较粗且明亮，证明DNA进行了特异性的扩增。

3.3连接转化后的大肠杆菌平板
图3.3 长有转化子的平板
分析：从图中可以看出平板上长有菌落，但菌落数很少，可能大部分ADK基因未能与质粒连接，或者是带有目的基因的质粒没有成功导入大肠杆菌，所以在加有抗生素的LB平板上具有抗性基因的大肠杆菌比较少，也可能是培养的时间不够，大肠杆菌菌落还没有长出来
3.4 PCR产物电泳检测结果
分析:在此步骤中，从图中可以看出，一，二，三班均有菌转化成功，但是一班，二班条带过于模糊不清晰，所以在后面的实验中使用的是三班的转化菌。

条带模糊或没有的原因可能为：1，在平板中取菌时，取量过少。

2，PCR循环只循环了31次，通常为33次。

3，仪器出现误差。

4，试剂加入量有误差。

目的片段对应marker区段有误，原本应该对应850bp左右，但是图中对应为650bp左右，原因是扩充的引物出现问题，拿成了仅仅扩充ADK基因的引物，但是对实验结果没有影响。

3.5 反义表达载体的酶切鉴定
因PCR后电泳结果显示我们小组的PCR产物较少，故换用3班号菌株进行反义表达载体的酶切鉴定，结果如下图所示：
图3.5 反义表达载体pHB-aIb ADK双酶切鉴定
M1：DNA分子量标准DL2000(TaKaRa)
M2：DNA分子量标准λHin dIII (TaKaRa)
泳道1-4（1班）、5-7（2班）、8（3班）：pHB-aIb ADK被Bam HI+Xba I完全双酶切的电泳结果
分析：此图中1~4泳道的为三班一号菌种，是09一班实验结果。

5~8泳道为三班2号菌种，是09二三班实验结果。

可明显看到条带，但是第3,4泳道在PHB目的基因下方还有条带，这是不正常的，应该只出现PHB和ADK条带，如同5~8泳道一样。

出现此问题的原因可能为1，原三班一号培养瓶中菌种出现了杂菌。

2，在实验操作过程中受到污染。

3、质粒提取时，加入P3后离心，沉淀均附着在EP管壁上，于是进行了2次离心，离心前震荡EP 管动作过大，可能混有基因组DNA片段或质粒本身受到破坏。

4.实验小结
基因工程实验总结
这次基因工程的实验基本上算是我们大学期间的最后一次实验课程了，因而显得尤其珍贵，所以我们小组的所有组员对这次实验也都非常用心，做起实验来也是格外认真。

这次实验算是是接着以前的分子生物学的实验做的，一共连续四天，四天的时间里又让我们学习了很多，收获了很多，现总结如下：
第一，我们对杨老师的“切、接、转、筛、扩、检”六字口诀有了更深的领悟。

无论是以前做的分子生物学实验还是这次的基因工程实验，其核心都可以概括为这六个字。

而只要
甘薯ADK基因反义载体的构建
想到这六个字，我们就能把握整体的实验设计思路，完成实验时也更加得心应手。

第二，基因工程的实验让我们完成了理论到实践的转化。

“纸上得来终觉浅”书本上的理论知识要真正消化还是要通过实践，这次的实验就给了我们实践的机会，让我们能把平日里学到的理论知识得以应用，也让我们把理论知识掌握得更加扎实。

第三，在实验过程中，非常重要的是要细心。

因为是分子水平的实验，我们肉眼看不到当前的反应现象和结果，只有等到实验结束了，通过检测才能知道成功与否。

如果失败了，重新再做的话，是非常耗时的，加上试剂很贵，所以在每一步都要非常细心，绝不能有半点马虎。

特别是加试剂的时候，每一种试剂的量、加试剂的顺序，反应的时间等等，都不能出半点差错。

第四，小组内成员的相互合作也是实验成功与否的关键。

我们虽然是第二次做基因工程的有关实验，但是构建表达载体却是第一次做，都没有什么经验，有的时候难免忙中出错，所以需要小组内其他成员的监督。

第一次操作的话，肯定都很生疏，做实验的速度会很慢，这时候就需要组内成员的协作。

在我们所有小组成员的共同努力下，我们的实验是非常成功的。

第五，这次实验体现了我们班班级的凝聚力，实验将我们紧紧的团结在一起。

因为实验，原本各顾各的我们重新聚在了一起，一起上课，一起实验，甚至一起说笑都让我们变得非常珍惜，我们都知道以后这样的时日恐怕很难再有。

因此，带着感恩、珍惜的心情，我们变得更团结了，同学与同学之间的关系也变得更和谐了。

另外，本次实验也有做的不足之处，那就是实验操作分工不均。

由于实验操作的的机会有限，有的同学参与操作的多一些，但有的同学参与操作的非常少，甚至整个实验都没有操作过，我们组也有类似的情况出现，但是基本上是保证了每位组员全程参与实验，每位组员都有机会操作。

最后，这次实验是在杨老师和曾老师的指导帮助下，我们才得以成功的完成了这次实验，在此特向两位老师表示感谢！
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