生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)

生物化学实验示范报告:
实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化
实验目的:
1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；
2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；
3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；
4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。

实验原理：
蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。

酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。

但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。

有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。

操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。

蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。

它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。

蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。

在本实验条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位；通过Folin法测定酶蛋白的含量，计算蔗糖酶的比活。

单位质量的酶蛋白中所含酶的活力称为酶的比活。

主要实验器材：
1. 试管、血糖管；
2. 秒表；
3. 冰盐浴；
4. 恒温水浴；
5.离心机；
6. 721- 型分光光度计；
7. 柱层析装置； 8. 梯度洗脱装置；9. 部分收集器；10. 电磁搅拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纤维素。

实验操作
1．蔗糖酶的分离提纯
（1）．蔗糖酶粗品的制备流程：
250mL具塞三角瓶＋酵母粉＋1.5g乙酸钠＋25mL甲苯于35o C恒温水浴中搅30min →补加水60mL，搅匀，用塑料薄膜封口，35℃保温过夜→自溶液于4000r/min离心20min，取中间水层液再次在4000r/min 离心20min，得无细胞抽提液（初酶E1）→测量初酶液的体积V1，并取出5mL待测酶活力和酶蛋白浓度。

实验得到的初酶液体积V1 = 48.5 mL，留5mL测酶活及酶蛋白，其余43.5mL做后续纯化实验。

（2）．乙醇分级和透析流程：
将43.5mL初酶液用稀醋酸调节pH值至4.5 → 32％的乙醇饱和度除杂蛋白（计算所需95％乙醇的量并与初酶液在冰盐浴中预冷，缓慢滴加95％乙醇并不断搅拌。

滴加结束后，于4000r／min离心5min，留取上清液）→再用95％乙醇调节酶液到47.5％的乙醇饱和度，沉淀蔗糖酶（此时需准确计算出使粗酶液的乙醇浓度达47.5％时所需补加95％乙醇的体积；按上述方法加入乙醇后于4000r／min离心5min）→透析（沉淀立刻用10mL 0.005mol／L，pH6.0的磷酸钠缓冲液溶解后，转入透析袋中，将透析袋放入500mL 烧杯中，加清水透析过夜（中间换一次清水）→次日，将透析液离心得酶液E2 ，准确测量出酶液E2的体积Ｖ2，并取出5mL待测酶液，测定酶的活力和蛋白浓度。

实验得到的乙醇分级和透析纯化后的酶液体积为13.8 mL，考虑到初酶液留下的5mL，则纯化后的酶液体积校正后应为：V2 = 13.8 ×48.5 / (48.5-5) = 15.39 (mL)。

问题1: 乙醇分级纯化的目的是什么？分级纯化后透析的目是什么?
2：乙醇分级和透析纯化后的酶液体积为什么需要进行校正？如何较正？
（3）．DEAE—纤维素离子交换层析法纯化：（由于实验条件和学时数所限，此步省略）
2．牛血清蛋白和葡萄糖标准曲线定制
（1） Folin 法定制牛血清白蛋白标准曲线：按表1进行实验操作，并记录A 650nm 处测得的各浓度对应的OD 值，一并填入下表中。

再以蛋白质的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，即可得到标准曲线。

表1 Folin 法定制牛血清白蛋白标准曲线实验加样操作及数据记录表
试管编号
01234567200ug/mL 标准牛血清蛋白溶液/mL 0.000.300.400.500.600.700.800.90.03mol/L pH7.8磷酸缓冲溶液/mL 1.00
0.70
0.60
0.50
0.40
0.30
0.2
0.1
加Folin 试剂甲，充分振荡10min 后，加入Folin 试剂乙A 650nm
0.000
0.155
0.189
0.250
0.305
0.352
0.417
0.459
1mL 4mL
立即摇匀放入55℃水浴中保温5min
取出后用自来水冷却1min ，以0号试管为空白对照，在595nm 处比色测定OD 值
表2 Folin 法定制牛血清蛋白标准曲线微机数据统计表
0#1#2#3#4#5#6#7#0.0010.0013.3316.6720.0023.3326.6730.000.000.1550.1890.250
0.305
0.3520.4170.4590.00
0.150
0.201
0.2530.3050.356
0.408
0.459
实验数据的相关性因素( r )
线性回归方程斜率 ( a )线性回归方程截距 ( b)线性回归方程
0.0155-0.0046
Y = 0.0155X - 0.0046
0.9990
试管编号
标准牛血清蛋白显色浓度 ( ug / mL )回归方程对应浓度下的吸光度A 650nm 实验测试对应浓度的吸光度
（2） 3、5-二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线定制：按表3进行实验操作，并记录A 540nm 处测得的各浓度对应的OD 值，一并填入下表中。

再以葡萄糖的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，即可得到标准曲线。

表中试剂混匀后，在沸水浴中准确反应15min ，取出后立即用冷水冷却，加蒸馏水定容至25mL ，摇匀，用lcm 的比色杯于540nm 处测光密度值。

表3 3、5 - 二硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线实验加样操作及数据记录表
试管编号
12345678
9
10
2000ug/mL 葡萄糖标准溶液/mL 0.000.200.400.600.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00蒸馏水（mL ）
2.00
1.80
1.60
1.40
1.20
1.000.80
0.60
0.40
0.20
0.00
3、5 - 二硝基水杨酸（mL ）
A 540nm
0.000
0.053
0.108
0.162
0.217
0.274
0.324
0.368
0.414
0.463
0.503
3.0mL
立即摇匀放入沸水浴中准确反应15min
取出后用自来水冷却，用蒸馏水定容至25ml 后，以0号试管为空白对照，在540nm 处比色测定OD 值。

表4 3、5 - 二硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线微机数据统计表
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1632486480961121281441600.000.0530.1080.1620.2170.2740.3240.3680.4140.4630.5030.01
0.059
0.110
0.161
0.212
0.262
0.313
0.364
0.415
0.466
0.517
实验数据的相关性因素( r )
线性回归方程斜率 ( a )线性回归方程截距 ( b)线性回归方程
试管编号
标准葡萄糖显色浓度 ( ug / mL )回归方程对应浓度下的吸光度A 540nm 实验测试的吸光度0.00320.0082
Y = 0.0032X + 0.0082
0.9990
3．蔗糖酶活力、蛋白浓度、比活力的测定
（1）通过预备实验确定酶活测定以及酶蛋白含量时酶的稀释倍数.
（2）蔗糖酶活力测定操作：
取2支试管，1支加入用pH4.6，0.2mol／L的醋酸缓冲液适当稀释过（稀释倍数均为50）的酶液（E1、E2）2mL，另一支加入2mL 5％的蔗糖液，把两支试管放入35℃水浴中预热恒温。

3分钟后，将2mL蔗糖加入到酶液试管中，准确计时，3min后于测定管中加入0.5mL 1mol／L的NaOH，摇匀，终止酶促反应。

从酶促反应液准确移取0.5mL溶液放入血糖管中，加入2mL 2%的3,5-二硝基水杨酸试剂摇匀。

于沸水浴中准确反应15min后，加水稀释至定容至25mL，摇匀后，于540nm处测光密度。

问题3: 测定蔗糖酶活力时，酶液为什么要进行稀释？如何确定酶液的稀释倍数？
4: 测定蔗糖酶活力时，反应液中先后加入0.5mL 1 mol／L的NaOH的目的是什么？
实验测得：稀释50倍的粗酶液催化生成还原糖的吸光度A初葡萄糖= 0.231 ；
乙醇分级纯化后稀释50数的酶液催化生成还原糖的吸光度A纯葡萄糖= 0.683
（3）酶蛋白浓度测定：
分别将初酶液(稀释100倍)与乙醇分级纯化后的酶液(稀释10倍)按Folin法进行蛋白质测定。

问题5：测定酶蛋白浓度时，酶液是否需要进行稀释?
实验测得：初酶液中蛋白质显色反应测得的吸光度A初蛋白质= 0.384 ；
乙醇分级纯化后蛋白质显色反应测得的吸光度A纯蛋白质= 0.490
将以上实验数据代入蛋白质标准曲线回归方程：Y = 0.0155X - 0.0046计算蛋白质含量。

初酶液中蛋白质浓度= 100 × [6 × ( 0.384＋0.0046)/0.0155 ]/1000 = 15.04（mg/mL）
初酶液中蛋白质含量= 48.5 ×15.04 = 729.57(mg)
乙醇分级纯化后蛋白质浓度= 10 × [6 × ( 0.490＋0.0046)/0.0155 ]/1000 = 1.915（mg/mL）
乙醇分级纯化后蛋白质含量= 15.39 ×1.915 = 29.47 (mg)
（4）酶活力测定的相关数据处理
a. 通过葡萄糖标准曲线测定得到的回归方程：Y = 0.00318X + 0.0082 （Y为吸光度，X为糖浓度）将测得的吸光度代入回归方程，分别计算出蔗糖酶纯化前后催化生成的葡萄糖的量（mg）
初酶稀释液催化生成的葡萄糖浓度C初葡萄糖= [50 × (A初葡萄糖－0.0082) / 0.0032]/1000
= [50 × (0.231 －0.0082) / 0.0032]/1000 =3.4813 (mg/mL) 2mL初酶稀释液催化生成的葡萄糖量（mg）= 4.5 ×初酶液催化生成的葡萄糖浓度C初葡萄糖= 15.67（mg）初酶酶活浓度=50 ×初酶液催化生成的葡萄糖毫克数/参与反应酶体积=50 × 15.67/2 = 391.75（U/mL）初酶液总酶活= 初酶酶活浓度×初酶液体积= 391.75 × 48.5 =18999.88（U）
乙醇分级纯化后稀释酶液催化生成的葡萄糖浓度C纯葡萄糖=[50 × (A纯葡萄糖－0.0082)/0.0032]/1000
=[50 × (0.683 －0.0082) / 0.0032]/1000 = 10.54 (mg/mL)
2mL纯酶稀释液催化生成的葡萄糖量（mg）= 4.5 ×纯酶液催化生成的葡萄糖浓度C初葡萄糖= 47.43（mg）；
纯化后酶的酶活浓度= 50×纯酶液催化生成的葡萄糖毫克数/参与反应酶体积= 50 × 47.43 /2=1185.75（U/mL）
纯酶液总酶活= 纯酶液酶活浓度×纯酶液体积×纯酶液稀释倍数= 1185.75×15.39 = 18248.69（U）
（5）酶比活、提纯倍数及回收率的计算：
初酶液酶比活 = 初酶液总活力/初酶液中蛋白质含量= 18999.88 / 729.57 = 26.04 (U/mg)
乙醇分级纯化后酶液的比活= 1837.6 / 29.47 = 619.23 (U/mg)
蔗糖酶的提纯倍数 = 乙醇分级纯化后酶液的比活/初酶液酶比活 = 619.23 / 26.04 = 23.78（倍）
蔗糖酶的回收率 = 乙醇分级纯化后酶液总活力 / 初酶液总活力 = 18248.69 / 18999.88 = 96.05%实验结果统计与结果讨论
1．实验结果数据统计表
蔗糖酶酶液体积
（mL）
酶活浓度
（U/mL）
总活力
（U）
蛋白浓度
（mg/mL）
总蛋白量
（mg）
比活力
（U/mg）
提纯倍数
回收率
（％）
E148.539.418999.8815.040729.4426.05
E215.39119.418248.69 1.91529.47619.19
23.7796.05 2．实验结果分析总结：（此分析结果不涉及离子交换柱层析的纯化处理）
通过实验统计可以明显看出：在提取蔗糖酶过程中，采用乙醇分级纯化透析处理后，得到的蔗糖酶其总活力略有下降，但其阶段收率任能达到96.05%；同时其比活力明显提高，提纯倍数达到23.77倍。

回顾整个蔗糖酶提取及纯化操作，为提高阶段收率保持酶的总活力，在操作过程中需注意以下环节：首先是在乙醇的分级纯化时，应根据蔗糖酶蛋白与其它杂蛋白因结构及分子大小不同等特性，选择好适宜的乙醇浓度除去杂蛋白，沉淀、纯化分离到蔗糖酶。

其次是在酶的纯化过程中，要确保酶只发生可逆沉淀反应而不变性：由于中性有机溶剂的强脱水作用而使酶蛋白变得不稳定，易产生沉淀，而使酶蛋白性质变得不稳定。

这种不稳定性往往受温度影响大，温度高时，其可逆沉淀反应会转变成不可逆沉淀反应，因此乙醇分级纯化过程应在冰盐浴中进行，同时要控制加入乙醇时的速度与方式，防止局部乙醇浓度过高造成酶蛋白变性。

乙醇处理完备后，应尽快消除沉淀剂对酶蛋白的影响，确保酶蛋白快速复溶，恢复其天然属性。

再次是测定酶活时，需严格按照酶活的定义，控制酶促反应的温度与时间，确保测得的数据真实有效。