质粒提取及双酶切鉴定

三、DNA琼脂糖凝胶电泳
原理 在 pH8.0（碱性）的环境中 DNA 的磷酸基团解离，使 DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为
各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝
胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有 差异，以此达到分离的目的。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外 光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。
它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。
质粒DNA的一般特性：
①质粒是细菌内的共生型遗传因子有相对独立性。 ②它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。
③是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。
质粒DNA与宿主菌染色体DNA的两点不同：
★ 宿主菌染色体 (chromosome)DNA 通常比质粒 DNA要大得多。 ★ 纯化分离的宿主菌 DNA 多为线性分子，而质
注意事项：
1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型（pUC119 或 pUC119-U6 ）； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾捅中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要 沾到皮肤。
EcoRⅠ、HindⅢ切割重组质粒
双酶切体系：
ddH2O 质粒DNA 10×M buffer EcoRⅠ HindⅢ
6μl 10μl 2μl 1μl 1μl
合计
20μl
单酶切体系：
ddH2O 质粒DNA 10×M buffer HindⅢ
7μl 10μl 2μl 1μl
合计
20μl
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列, 并
粒DNA呈闭合环的形式。
提取质粒DNA的目的与意义
★ 是基因克隆(gene clone)的第一步（分离 得到转运目的基因的载体）； ★ 为基因重组(gene recombination)作准备； ★ 质粒可以直接转化(transform)细胞； ★ 为目的基因(target gene)的表达提供条 件。
SDS碱裂解法抽提质粒的主要试剂
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•Cl组成.
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减小抽提过
程中的机械剪切作用,防止破坏质粒。
EDTA 的作用是络合镁等二价金属离子,防止
DNA 酶对质粒分子的降解作用。
Tris•Cl调节溶菌液维持溶菌作用的最适PH范
围。
溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成 SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结 合使之变性； NaOH的作用是破坏氢键，使DNA分子变性。
有机溶剂、金属离子、外源DNA、RNA等）

分离纯化质粒 DNA的方法有很多种：
碱裂解法、煮沸法、 high pure plasmid
isolation kit 等。各种方法原理相似，都是利 用两种 DNA 的差异来分离的，因此它们有共同的
步骤：
① 培养细菌使质粒扩增
② 细菌的收集与裂解
收集——菌液高速离心的方法 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂 法、碱裂解法、沸水裂解法、溶菌酶法、超声 处理法等。根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂 解后的纯化方法等因素综合后加以选择。
分子医学技能
Department of biochemistry & molecular biology
张
彦
TEL: 87330621
质粒DNA的制备、鉴定
内切酶切割重组质粒
（p70、p81）
一、概述
什么是质粒（plasmid）
质粒是存在于细菌体内的一类独立于染色
体的可以自主复制的双链环状DNA，在细胞内
基因载体（gene vector）
＊什么是基因载体
把一个有用的目的DNA片断通过重组DNA技术， 送进受体细胞中去进行复制和表达的工具 ＊基因载体的作用 ※为目的基因提供进入受体细胞的转移能力 ※为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整 合）和表达 所需条件
基因载体应具备特点:
★ 具有独立复制能力，在细胞中能大量繁殖， 从而使目的基因大量扩增 ★ 具有适当的限制性内切酶识别和切割位点 ★ 具有供筛选用的遗传标记
★ 作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达 目的基因 ★ 相对分子量小 ★ 细胞内稳定性高 ★ 可转移性
基因载体类型
★ 质粒，噬菌体(phage)，病毒(virus)DNA
二、质粒DNA提取原理与方法
核酸分离纯化的总原则：
保证核酸一级结构(primary structure)完整
排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、糖、
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
影响限制酶活性的因素
1）“星”活性 酶的特异性改变或特异性降低而呈现的活性。 EcoRⅠ：GAATTC EcoRⅠ*： AATT 2）甲基化 识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 3）底物性状 4）试剂：缓冲系统
注意：
1、灌胶时应避免出现气泡；
2、拔梳子时动作要轻柔，注意不要将胶 拔碎； 3、加样时动作要果断而轻柔； 4、EB具有致癌作用，染色时戴手套； 2、观察完毕之后凝胶扔到垃圾桶中；
RNA
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SC LC OC
型型质 质质粒 粒粒
DNA
细 菌
DNA DNA DNA
点 样 孔
细 菌 基 因 组
常见问题：
1、提取的DNA不纯：
变性不充分；关键过程反应时间过短； 离心时间或速度不够。 2、提取的DNA成涂布状： 操作过程中用力过猛，动作粗暴；
操作系统有污染。
3、与染色体DNA分离不全： 变性过程不完全；
Hin dⅢ
属 系 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG 切口 ：平端切口、粘端切口
使细菌线性染色体片段氢键断裂，双链解开变性，而质粒
DNA共价闭合环状的双链并不完全分离，当加入高浓度酸性 盐时，pH值恢复至中性，并在有高盐存在的条件下：变性染
色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成不溶性沉淀物
；质粒DNA又恢复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过 离心可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除去。
在识别位点或其周围切割双链 DNA 的一类内
切酶。
限制性核酸内切酶
存在于细菌体内
切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制 性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手 术刀”）
分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修 饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
命名
③ 质粒DNA的纯化
常用的方法有：超速离心、层析法、 聚乙二醇沉淀法等。 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相 对较小及共价闭合环状的性质。
SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：
在有 EDTA 及去污剂（ SDS）存在的条件下，用碱处理细
菌，可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体 DNA、蛋白质和 RNA 等），强碱环境（ pH12.0~12.6）可以
溶液III：由冰醋酸和KAc组成。能中和溶液Ⅱ的 碱性，使质粒DNA复性，并为染色体DNA缠绕提供 盐环境。
实验步骤及注意事项：
加1.5ml培养物于EP管，12 000rpm×30sec 弃上清，倒置EP管于卫生纸上使液体流尽。 加入100ul溶液I重悬沉淀，剧烈震荡EP管，摇匀。
加入200μl溶液II，快速温和颠倒数次
实验步骤： 1、胶带封制胶板两端（示教）；
2、放好梳子，等胶稍稍冷却后灌胶；
3、待胶凝固后撕去胶带，将制胶板放在电泳槽中， 轻轻拔掉梳子； 4、加样（10μl质粒和2μl loading buffer在胶带上 混匀）；
5、接通电源，开始电泳（120V）;
6、蓝色条带快到终点时停止电泳，EB染色5min； 7、漂洗后紫外灯下观察结果。
加入150 μl冰冷溶液III，颠倒10s，冰浴4min， 12000rpm×5min
转移上清到新EP管，加入等体积的酚/氯仿（1:1）,混 匀,12000rpm ×5min 转移水相至新EP管，加两倍体积无水乙醇，混匀， 12000rpm×5min 弃上清，倒置管于卫生纸上使液体流尽 沉淀中加入1ml 70%乙醇， 12000rpm×5min 去上清，静置5min干燥,TE 20 μ l 溶解质粒