第三章毛细管电泳法讲述介绍

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是现代微柱分离技术和经典电泳技术结合的产物,
是气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)等常用分
离技术的重要补充,在诸多研究领域得到了人们 广泛的接受和认可。
一、毛细管电泳发展历程



1808年,俄国物理学家 Pence 发现电泳现象。 1937年,瑞典Tiselius将蛋白质混合液放在两段缓冲溶 液之间,两端施以电压进行自由溶液电泳,发现样品的 迁移速度和方向由其电荷和淌度决定,第一次从人血清 提取的蛋白质混合液中分离出白蛋白和α、β、γ球蛋 白,但分离效率低; 1981年,Jorgenson在75μm毛细管内施加300 V/cm的高 强度电场,获得了理论塔板数超过400,000 plates/m的 高分离效率,轰动了整个分离界,成为CE划时代里程碑 1989年,毛细管电泳仪问世。 1989年,第一届CE国际会议的召开,标志着一门新的分 析技术的产生。
+

CE中电渗流的作用:

可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离; 改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性

电渗流的微小变化影响结果的重现性;
在CE中,控制电渗流非常重要。
4.CE中影响电渗流的因素
(1)电场强度的影响
电渗流速度和电场强度成正比,当毛细管长度一
定时,电渗流速度正比于工作电压。
加入有机溶剂如甲醇、乙腈,使电渗流增大。
三、CE中的参数与关系式
1.迁移时间(保留时间) CE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理 论也适用。 ldet ldet ldet ltot t ap ap E ap V
Vap是表观迁移速度;μap是表观淌度;ldet 是毛细管有效长度; ltot 是毛细管总长度
四、影响分离效率的因素—区带展宽
1. 纵向扩散的影响 在CE中,纵向扩散引起的峰展宽:σ2=2Dt
由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小, 可获得更高的分离效率。
2. 进样的影响
当进样塞长度太大时,引起的峰展宽大于纵向扩散。 分离效率明显下降;理想情况下,进样塞长度:
Winj= (24D t )1/2
μ
ef

ef
E

q 6 πr
由此可知,球形带电离子的迁移率,主要取决于自身状态,即与其所带电 量成正比,与其半径及介质粘度成反比。电泳过程中正是利用带电离子电 泳迁移速度或迁移速率的差异来实现分离的。
二、电渗流

石英毛细管柱,内壁大约有8.31 mol/m2的硅醇基
(Si-OH),其等电点约为1.5,内充液pH>3时,表

电场强度:与所施加的电压成正比,与两电极间的距离(L)成反比
E=V/L

电场力:在溶液中,电场对带电离子作用力(F)的大小等于带电离子所带
的净电荷(q)与电场强度的乘积:
F=q· E

在电泳迁移过程中,介质粘滞力(F’)必然会阻碍离子的迁移。 粘滞力的大小与离子大小、形状、缓冲液粘度、甚至电泳介质孔径均有关系, 与带电离子的移动速度更是直接相关。对于球形分子F’的大小服从Stokes 定律:

(5)高度自动化:CE是目前自动化程度最高的分离分析
方法之一;

(6)洁净:通常用水溶性缓冲液,对人体和环境无害;
(7)多分离模式:可根据需要在同一仪器上选用不同的
样品分离模式;

(8)应用范围广:具有“万能”分析的功能和潜力,既 可以分析无机离子、氨基酸、药物等小分子,又可以 分析蛋白质等生物大分子,甚至整个细胞和各种微粒。
二、毛细管电泳的特点
CE是现代微柱分离和经典电泳技术有机结合的产物,具有较
HPLC和平板凝胶电泳更多的优点:

(1)高效:每米理论塔扳数低则十几万,高则几百万甚 至上千万;

(2)快速:可在十几分钟甚至几十秒内完成分离; (3)低样品消耗:只需纳升甚至皮升级样品量; (4)低成本分析:只需低廉的分离毛细管和少量的运行 缓冲液;
( eof ep )Vπ r 2 ct 进样量 t L
进样不均:电歧视现象,淌度大的离子比淌度大的进样量大; 离子丢失:淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去; 特别适合黏度大的试样。
3. 扩散进样
试样通过扩散作用进入分离柱端口处。
第四节 毛细管电泳类型
常用的六种电泳分离模式;
根据试样性质不同,采用不同的分离类型; 每种机理的选择性不同;
实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的 1%~2%。
3.焦耳热与温度梯度的影响
电泳过程产生的焦耳热可由下式计算:
Q
V I π r2L
Λm cb E 2
m:电解质溶液的摩尔电导;I:工作电流:cm:电解质浓度;
散热过程中,在毛细管内形成温度梯度(中心温度高),破 坏了塞流,导致区带展宽。
第二节 毛细管电泳基础理论
+

一、电泳流

电泳:在电解质溶液中,位于电场中的带电离子
在电场力的作用下,以不同的速度向其所带电荷
相反的电极方向迁移的现象。


+பைடு நூலகம்
电泳时,不同离子在电场中具有不同的定向迁移 速度,迁移速度与哪些因素有关?
淌度(μ):单位电场下的电泳速度。 绝对淌度:在无限稀释溶液中测得的淌度。 有效电泳淌度:在实际溶液中测得的淌度。
常数有关,某一电泳体系内电渗流的具体数值可以 用Helmholtz-Smoluchowski 公式计算:
eof
ε V ε V ( )( ) eof E ltot ltot
eof为电渗速度; eof 为电渗淌度(EOF mobility); 为双 式中, 电层的Zeta电位; 为缓冲液介电常数;η为电解液粘度;V 为所施加的电压; ltot 为毛细管总长度。

在具体实验中,可根据需要选用不同的中性组分作为标
记物(N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酰胺、苯酚、 丙酮等),测定不同缓冲条件下中性标记物的迁移时间, 按下述公式计算出电渗率:
eof
ldet ldetltot E tE t V
eof
其中,t:中性标记物的迁移时间,ldet为毛细管电泳有 效长度, ltot为毛细管电泳有效长度。
面电离成SiO-,管内壁带负电荷,形成双电层。

在高电场的作用下,带 正电荷的溶液表面及扩 散层向阴极移动,由于 这些阳离子实际上是溶 剂化的,故将引起柱中 的溶液整体向负极移动, 形成电渗流。
1. CE中电渗流的大小与方向
电渗流的大小可用电渗速度和电渗淌度表示。
(1)电渗流的大小

电渗流的大小与电场强度、Zata电势及缓冲液介电
灵敏度高,样品需衍生
灵敏度极高,样品需衍生 离子灵敏,需专用的装置;
二、毛细管电泳的进样方式
进样量:毛细管长度的1%-2%;纳升级、非常小;
1.流体力学进样方式
(1)进样端加压 (2)出口端抽真空 (3)虹吸进样
Pd 4 π 进样体积 t 128 L
2.电动进样方式
毛细管一端插入样品瓶,加电压;
一、毛细管区带电泳
(Capillary zone electrophoresis , CZE) 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子:两种效应的运动方向一致,在负极最先流出; 中性粒子:无电泳现象,受电渗流影响,在阳离子后流出;
阴离子:两种效应的运动方向相
反;ν电渗流 >ν电泳时,阴离子在负极 最后流出,在这种情况下,不但可以 按类分离,同种类离子由于差速迁移 被相互分离。 CZE是最基本、应用广的分离模式;
稳定并调控pH。
② 阴离子的影响
在其它条件相同,缓冲液浓度相同而阴
离子不同时,毛细管中的电流有较大差别,
产生的电渗流不同。
(4)温度的影响

毛细管内温度升高,使溶液的黏度下降,电渗流增大。


温度变化来自于“焦耳热”;
焦耳热:毛细管溶液中有电流通过时,产生的热量; CE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场 强度成正比。 温度每变化1度,将引起背景电解质溶液黏度变化 2%~3%;
(2)毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷 特性不同,产生的电渗流大小不 同。
(3)电解质溶液性质的影响
① 溶液pH的影响
对于石英毛细管,溶液pH增高时,
表面电离多,电荷密度增加,管壁zeta 电势增大,电渗流增大。pH在4-7之间, 电渗流增大显著;pH>8时电渗流增大速 度渐缓。 当pH<3,毛细管内壁离解的硅醇基 被氢离子中和,表面接近电中性,电渗 流接近零。分析时,可采用缓冲溶液来

3.CE中电渗流的作用

电渗流的速度一般约等于离子电泳速度的5~7倍; 各种电性粒子在毛细管柱中的迁移速度为:


阳离子迁移速度 =电渗流+电泳流,阳离子运动速度快于电渗流;
阴离子迁移速度 =— 电渗流–电泳流,阴离子运动速度慢于电渗流; 中性粒子迁移速度 =电渗流,中性粒子运动速度与电渗流一致。
毛细管内径一般为20~100μm。
3.缓冲液池
化学惰性,机械稳定性好;
4.检测器
要求:具有极高灵敏度,可柱端检测; 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化; 类型 紫外-可见 检测限/mol 10-13~10-15 特点 加二极管阵列,光谱信息
荧光
激光诱导荧光 电导
10-15~10-17
10-18~10-20 10-18~10-19
F’=6πηrνef
η:缓冲液粘度;r:球形分子的半径;νef:离子在电场中的迁移速度。
当带电离子以速度ν 在电场中移动时,受到大小相等、方向相反的电场驱 动力和平动摩擦阻力的作用,此时
F=F’
故:
q· E= 6πηrνef
则离子在电场中的迁移速度:
ef
qE 6πr
即带电离子的电泳迁移速率(或称电泳淌度) :
改善方法:
(1)减小毛细管内径; (2)控制散热;
4.溶质与管壁间的相互作用
蛋白质、多肽带电荷数多,吸附问题特别严重,是目前分 离分析该类物质的一大难题。 细内径毛细管柱,一方面有利于散热,另一方面比表面积 大,又增加了溶质吸附的机会。
减小吸附的方法和途径:加入两性离子代替强电解质,两
性离子一端带正电,另一端带负电,带正电一端与管壁负电中 心作用,浓度约为溶质的100-1000倍时,抑制对蛋白质吸附, 又不增加溶液电导,对电渗流影响不大。
2.分离效率(塔板数) 在CE中,仅存在纵向扩散,σ2=2Dt
n
apVldet
2DL

ap Eldet
2D
;
tR n 5.54 W 1/ 2

2
扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高,这是分离 生物大分子的依据。
3.分离度
2(t 2 t1 ) R W2 W1
(2)CE中电渗流的方向

石英毛细管带负电荷,溶液带正电荷,电渗流 流向阴极;

改变电渗流方向的方法:
毛细管改性:表面键合阳离子基团; 加电渗流反转剂:
内充液中加入大量的阳离子表面
活性剂,将使石英毛细管壁带正电荷,溶液表面带 负电荷。电渗流流向阳极。
2.CE中电渗流的流形

液相色谱中的溶液流动为层流,抛物线流型,管壁 处流速最慢,管中心处的速度为平均速度的 2倍(引 起谱带展宽较大)。 在毛细管电泳中,电荷均匀分布,整体移动,电渗 流的流动为平流,塞式流动(谱带展宽很小),故 柱效较高。
第三节 毛细管电泳仪
一、仪器主要部件
1.高压电源
(1)0~30 kV 稳定、连续可调的直流电源;
(2)具有恒压、恒流、恒功率输出;
(3)电场强度程序控制系统;
(4)电压稳定性:0.1 %;
(5)电源极性易转换;
2. 毛细管
毛细管是CE分离的心脏。
理想的毛细管必须是电绝缘、 紫外/可见光透明且富有弹性 的,目前可以使用的有玻璃、 熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。
第三章 毛细管电泳法
Capillary Electrophoresis

第一节 毛细管电泳概述 第二节 毛细管电泳基础理论 第三节 毛细管电泳仪


第四节 毛细管电泳类型
第五节 毛细管电泳的应用和进展
第一节 毛细管电泳概述

毛细管电泳(CE),又称高效毛细管电泳,是近
年来发展最快的高效分离分析技术之一。该技术

(5)添加剂的影响
加入浓度较大的中性盐,如K2SO4,溶液离子强度
增大,使溶液的黏度增大,电渗流减小。
加入表面活性剂,可改变电渗流的大小和方向;
加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。
加入阴离子表面活性剂,如十二烷基硫酸钠
(SDS),可以使壁表面负电荷增加,zeta电势 增大,电渗流增大;
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