粮食中真菌毒素的检测

粮食中真菌毒素的检测

一、前言

真菌是微生物中的高等生物，是一类有细胞壁，不含叶绿素，无根叶茎，以腐生或寄生方式生存，能进行有性或无性繁殖的微生物。自然界中的真菌分布十分广泛，并可作为食品中正常菌相的一部分用来加工食品，但在特定情况下又可造成食品的腐败变质。有些真菌本身不仅作为病原体引发人类疾病，其代谢产物真菌毒素(mycotoxins)也对人及动物造成危害。真菌毒素是农产品的主要污染物之一，人畜进食被其污染的粮油食品可导致急、慢性真菌毒素中毒症。

1.1粮食中典型的真菌毒素

1）黄曲霉毒素(aflatoxin)主要是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，黄曲霉毒素污染的发生和程度随地理和季节因素以及作物生长、收获、贮存的条件不同而异，粮油作物在收获后、贮藏期以及加工后都能受到产毒菌株污染，有时早在作物收获前就已受到了产毒菌株的污染。1960年在英格兰南部和东部地区，十几万只火鸡因食用发霉的花生粉而中毒死亡。剖检中毒死鸡，发现肝脏出血、坏死，肾肿大，病理检查发现肝实质细胞退行性病变及胆管上皮细胞增生。研究发现火鸡饲料中的花生粉含有一种荧光物质，是导致火鸡死亡的病因，并证实了该物质是黄曲霉的代谢产物，故命名为黄曲霉毒素。

2）赭曲霉毒素最初是从南非的赭曲霉毒株中分离出来的，由赭曲霉(Asper-gillusochraceus)、洋葱曲霉(Aspergillusalliaceus)、鲜绿青霉(Pencilliumviridicatum)、徘徊青霉等代谢产生，包括7种结构类似的化合物，赭曲霉毒素A是其中毒性最强的物质，是自然界中的主要天然污染物。在一些国家的食品中，赭曲霉毒素A的污染率可达2％～30％。该化合物主要表现为肾脏毒性。在巴尔干地方性肾病流行区，6％～18%人群的血液中能检出赭曲霉毒素A。3）展青霉毒素(Pat)，又叫棒曲霉毒素和珊瑚青霉毒素，主要是由棒曲霉(Aspergillusclavatus)、扩展青霉(Pencilliumexpansum)、展青霉(Pencilliumpatulium)、曲青霉(Pencilliumaspergillus)等代谢产生的一种免疫抑制剂。

4）单端孢霉烯族化合物是由头孢菌(ephalosporium)、镰孢菌(Fusarium)、葡萄状穗霉(Stachybotrys)和木霉菌(Trichodema)等代谢产生的一组生物活性和化学结构相似的有毒代谢产物。

5）玉米赤霉烯酮(ZEA)又名F一2毒素，是由镰刀菌属的菌种产生的代谢产物。最早是由染有赤霉病的玉米中分离得到的，是由禾谷镰孢(Fusariumgra-minearum)、黄色镰孢(Fusariumculuorum)、木贼镰孢(Fusariumeqlliseli)半裸镰孢(Fusariumsemitectum)茄病镰孢(Fusariumsolani)等菌种产生的。许多国家曾报道，猪和牛等家畜摄食被玉米赤霉烯酮污染的谷物或饲料后，可引起动物雌性激素中毒症。

1.2检测真菌毒素的常用方法：

1）薄层层析法：

TLC法是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将霉菌毒素从样品中提取出来，经柱层析净化，再在薄层板上层析展开、分离，利用霉菌毒素的荧光性，根据荧光斑点的强弱与标准比较测定其最低含量。TLC法样品前处理繁琐，且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多，在展开时影响斑点的荧光强度。

2）色谱法：

色谱法，包括薄层色谱、气相色谱、液相色谱等，一直是最重要的真菌毒素的化学分析方法。现在比较普遍的真菌毒素的分析方法还是液相色谱法，包括液相色谱-质谱联用技术。该法快速而准确，但需要昂贵的仪器设备，仅限于专业检测机构获得科研和调查分析、监测使用，未能在企业及基层广泛推广使用，而且其结果的滞后效应大大降低了对生产实际的指导效果。

3）免疫化学检测法：（胶体金免疫层析法，酶联免疫吸附法）

免疫学检测方法是基于抗体与抗原或半抗原之间的选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法。通常具有高的选择性和很低的检出限，广泛用于各种抗原、半抗或抗体的测定，一般可分为荧光免疫法、发光免疫法、免疫法及电化学免疫法等非放射免疫法和放射免疫法，其中在饲料霉菌毒素检测中应用较广的主要是酶联免疫吸附法（ELISA）和胶体金免疫层析法。

免疫学检测方法由于其快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高等特性，特别适用于饲料厂、粮油/食品加工厂、养殖场等企业进行原料或成品的检测以及工商质监部门现场检测。

该类方法有以下特点：

1、灵敏度高

2、干扰小：抗体抗原的免疫反应特异性很强，结构类似物、荧光物质、有色物质对检测的干扰很小。

3、操作简便快捷：由于特异性强，简化了样品的预处理和提取纯化过程，同时操作步骤也非常简便，测定时间也短。

4、安全性高，污染少，成本低廉：不需要昂贵的测定仪器，所用试剂也相对较少，特别是因为灵敏度高，毒素标准品的浓度可以很低，减少了对检测人员和环境的潜在危害和污染。

二、实验目的：

检测入仓小麦，稻谷，大米的真菌毒素。

三、实验原理

1.免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，英文缩写为:GICT。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。常用的免疫胶体金检测技术

（1）免疫胶体金光镜染色法

细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。

（2）斑点免疫金渗滤法

应用微孔滤膜（如膜）作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。

（3）胶体金免疫层析法

将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细