一种快速简便高通量筛选重组克隆的方法
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２ 结 果 与 分析
１ １ １ 质粒和菌株 转化试 验平板 由南 阳师 范学院陈吉 宝 ．． 博士惠赠 ， 该转化 试 验是 在 Ｔ—ｅｓ ａｙ载体 上 连接 大豆 ｃ Ｎ ＤＡ
片 段 ， 化 大 肠 杆 菌 Ｄ ５ 转 Ｈ。 １ １２ 试 剂 ．．
１２ ． 方 法
１ Ｓ Ｓ溶 液 为 裂 解 液 ； ａ ａｔ ｉｕｅ ％ Ｄ ２ＸＴｑｍ ｓ ｒｍｘ ｒ， ｅ ｔ
几 百 个 重 组 质 粒 的筛 选 。
关键 词 ： 重组质粒 ；高通量 筛选 ； 一步裂解 ；Ｄ Ａ迁移速率 ； Ｃ Ｎ ＰＲ
中图分 类号 ： ８２ Ｑ １ 文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ：０ ２—１０ （ ０ ２ ０ ０４ — ２ １０ ３２ ２ １ ）６— ０ １ ０
随 着各 种生 物试 验 的 大 规 模 开 展 ， 找 一 种 高 通 量 筛 选 寻
来 建 立 了不 少 简 单 快 速 的方 法 ， 些 方 法 都 大 大 缩 短 了 操 作 这
ｌ ｄｎ ｕ ｅ， ｏ ｉｇｂ ｆ ｒ迅速进行 ０ ８ ａ ．％琼脂糖凝胶电泳。 １２ ２ 从单菌落制备质粒 ．． 转化后的平板 ３ ７℃倒置培养过 夜至单菌落 长至 ２～３ｍ 用无 菌小枪头挑 取上述对应 的 ４ ｍ， 个单菌落 ， 加入 １ Ｄ ％Ｓ Ｓ溶 液 ２ ， Ｏ 涡旋混 匀或者 用枪头 吹 打混匀 ， 室温放置 ２ｍｉ，２０ ０ｒｍ ｎ离心 ３ｍｎ 取上清 ； ｎ １ ０ ｉ ／ ｉ， 加 入 ４Ｉ Ｌ６×Ｄ Ａ ｌ ｄｎ ｕ ｅ ， ｘ Ｎ ａ ｉ ｂ ｒ迅速 进行 ０ ８ ｏ ｇ ｆ ． ％琼脂糖 凝胶
江 苏农业科 学 ２ １ ０ ２年第 ４ ０卷第 ６期
董冰雪， 玉英， 李 叶壮清 ， 等．一种快速 简便 高通量 筛选重组克 隆的方法［ ］ 江苏农业科学 ， １ ， （ ）４ — ２ Ｊ． ２ ２４ ６ ：１ ４ ０ ０
一 ４ ｌ一
一
种快速简便高通量筛选 重组 克隆 的方法
董 冰 雪 ，李玉英 ，叶壮 清 ， 三春 ，李运 会 ，宋雅 菲 ， 耿 刘
２Hale Waihona Puke １ 用大肠杆 菌培养液制备质粒 ．
购 白天根生化科 技（ 北京） 有限公司 ；Ｂ Ｔ Ｅ电泳缓冲液。 １２ １ 在大肠 杆菌培养液 中制 备质粒 从转化试 验的平板 ．． 上任意挑选 ３个 白色、 １个蓝 色克 隆接种 到 液体 【 Ｊ 养基 Ｂ培
从 图 １可以看出 ， 白色克 隆的质粒 迁移 速率 明显慢 ３个
菌液 ，２００ ｒｍｉ 心 ３ １ ０ ｎ离 ／ ０Ｓ收集细胞 ， 除尽 上清 ， 入 １ 加 ％ Ｓ Ｓ溶液 ２ ， Ｄ Ｏ 涡旋 混 匀或 者用 枪 头吹 打混 匀 ， 室温 放置
２ｍ ｎ １ ０ ｍｉ 心 ３ ｍｎ 取 上 清 ； 入 ４ ｉ ，２００ ｒ ｎ离 ／ ｉ， 加 ６×Ｄ Ａ Ｎ
循环 ；２℃延伸 ５ｍ ｎ Ｃ ７ ｉ。Ｐ Ｒ结束后 取 ５
１２ ４ 琼脂糖 凝胶 电泳 ．．
进行 电泳。剩余
的模板 ４℃放置 ３周不影响扩增效率 ， 可以 一 ０℃长期保存。 ２ 质 粒 Ｄ Ａ用 ０ ８ Ｎ ． ％琼 脂糖凝 胶 ， Ｐ Ｒ产 物 用 １ 琼 脂 糖 凝 胶 ， Ｃ ％ １×Ｔ Ｅ缓 冲 液 ， 流 保 持 Ｂ 电 ８ Ａ， ０ｍ 电泳 ０ ７ ．５～１ｈ 。电泳结束后用 溴化 乙锭 （ Ｂ 染 色 ， Ｅ） 紫外灯下拍照 。
于对照 ， 明 ３个 白色克隆很 可能都插 入了外源片段 ； 说 而且 ３ 个质粒在凝胶上的迁移速率有 明显 差异 ， 说明载体上 面插入
的ｃＮ Ｄ Ａ片 段 可 能 大 小 不 同 。
２２ 单茵落制备质粒 ．
收 稿 日期 ：０ １—１ ０ ２１ １— ３
从 图 ２可以看出 ， 该方法 同样适合 于从 单菌落制 备。只
电泳。
时间 ， 简化了操作 步骤 。但 是这些方 法要 么需 要不常见 的化 学试剂 或者特殊材 料 或者 成分复 杂 的裂解 液 ］要 么 ， 是使用毒 性强 的苯 酚／ 氯仿／ 异戊 醇 （ ５： ４： ） ， 的要 ２ ２ １ ｊ 有 用到耗时且相对 昂贵的 Ｐ Ｒ ， Ｃ 甚至是 昂贵的试剂盒 。笔 者介绍一种使用单一试剂一 步裂解检测重 组质粒 的方法 ， 该 方法简便 、 廉价 、 快速 、 可靠 、 重复性强 ， 适合于任何化试 验 也 中快速筛选重组质粒。
院高层次人才科研启 动费（ 编号 ： ２ １ ００ ） ｚ ０ １０ ７ 。 ｘ
作者简介 ： 董冰雪（ ９７ １７ 一）， ， 女 河南方城人 ， 博士 ， 讲师 ， 主要从事分 子酶学及酶工程方面研究 。Ｅ—ｍａ ：ｏ ｇｉｇｕ２０ ＠１３ ｃｍ。 ｉ ｄｎｂｎｘ ｅ０４ ６ ．ｏ ｌ
１ 材 料 与方 法
１１ 材料 ．
１２ ３ 制 备 Ｐ Ｒ模 板 ．． Ｃ
如 果 想 得 到该 外 源 基 因 ， 以 对 用 可
“ ．． ” １２ １ 或者 “ ． ． ” １２ ２ 中的方法得到 的裂解液适当稀释 （ 稀释 １ ２ ０～ ０倍 ） 用作模板 ， ， 扩增 出 目的基 因。１ ， Ｃ ５ ｐ Ｐ Ｒ反应体 Ｌ 系含有 上下游 引物各 ０ ５ｐ ｏ ， 释后 的裂解 液 １Ｉ ， ． ｍ ｌ ／ 稀 ｘ Ｌ ２×Ｔ ｑｍ ｓ ｒ ｉ ｕｅ７ ５ Ｌ Ｃ ａ ａｔ ｘ ｒ ． 。Ｐ Ｒ扩增 程序 ：５℃预 变性 ｅｍ ｔ ９ ５ｍ ｎ９ ｉ；５℃变性 ３ ，４℃退火 ４ ，２℃延伸 １５ｍｎ３ ０Ｓ５ ５Ｓ７ ． ｉ， ０个
方法才能完成筛选 ， 因而需要建立一个快速 、 简便提取大量重 组 质粒 的方法 。尽管 目前存在着不少制备质粒 Ｄ Ａ的方 法 ， Ｎ 它们主要 由经典 的 Ｓ Ｓ一碱裂解法 …发展 而来 ， Ｄ 但是从操 作 时间、 Ｎ Ｄ Ａ质量、 本等方 面都存在 缺点 。碱 裂解 法 因可靠 成 性 强而被普遍接受 ， 整个操作繁琐 、 但 费时 ， 提取 １ ２个样品通 常要 ９ ０—１０ｍｉ。为了缩 短操作 时间、 高工作效 率 ， ２ ｎ 提 近年
（ 阳师 范学院生命科学与技术学院 ， 南 河南南阳 ４ ３６ ） ７０ １
伟
摘要： 介绍 了一种极其简单 、 快速 、 廉价 、 可靠 的从 ｃ Ｎ Ｄ Ａ文 库或者 转化平板 上高通 量筛选 重组质粒 的方法 。将 细 菌培养液或者转化平板上的单菌落直接用 １ Ｄ 一 步裂解 ， ％Ｓ Ｓ 琼脂糖凝胶快速 电泳 ， 据 Ｄ Ａ迁移速率判断是否重 根 Ｎ 组质粒 。裂解上 清液 可以稀释后直接用作 Ｐ Ｒ模板 ， Ｃ 扩增 出 目的基 因。利用这种方法可 以在 短短的几个 小时 内完成
上 ，７℃摇 床培养 至静止期 （ ３ Ｄ
＝１０～１ ５ ， ２０ ． ． ） 取 ０
重组克隆的方法就愈显迫切 。蓝 白反应（ ａ Ｌ ｃｚ的 互补 ） 使 许多插入外 源片段 的重组 质粒很容 易筛选 出来 ， 但是 在许多
情 况 下 重组 质 粒 不 含 有 筛 选 标 记 ， 须 通 过 提 质 粒 跑 电 泳 的 必
基金项 目： 河南省科 技攻关 计划 （ 编号 ： １ １２ １３ ５ ； 阳师范学 １２ ０ ２０ ８ ） 南
是菌落要长到 ２～ ３ｍｍ， 菌落太小则质粒条带不明显 ； 裂解时
间不宜过长 ， 间过 长会 使裂解液黏稠 ， 时 增加点样难度 ， 如果 裂解时间过 长， 裂解液变黏稠 ， 点样速度要慢 ， 以免 Ｄ Ａ从点 Ｎ 样孔 中跑出来。
１ １ １ 质粒和菌株 转化试 验平板 由南 阳师 范学院陈吉 宝 ．． 博士惠赠 ， 该转化 试 验是 在 Ｔ—ｅｓ ａｙ载体 上 连接 大豆 ｃ Ｎ ＤＡ
片 段 ， 化 大 肠 杆 菌 Ｄ ５ 转 Ｈ。 １ １２ 试 剂 ．．
１２ ． 方 法
１ Ｓ Ｓ溶 液 为 裂 解 液 ； ａ ａｔ ｉｕｅ ％ Ｄ ２ＸＴｑｍ ｓ ｒｍｘ ｒ， ｅ ｔ
几 百 个 重 组 质 粒 的筛 选 。
关键 词 ： 重组质粒 ；高通量 筛选 ； 一步裂解 ；Ｄ Ａ迁移速率 ； Ｃ Ｎ ＰＲ
中图分 类号 ： ８２ Ｑ １ 文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ：０ ２—１０ （ ０ ２ ０ ０４ — ２ １０ ３２ ２ １ ）６— ０ １ ０
随 着各 种生 物试 验 的 大 规 模 开 展 ， 找 一 种 高 通 量 筛 选 寻
来 建 立 了不 少 简 单 快 速 的方 法 ， 些 方 法 都 大 大 缩 短 了 操 作 这
ｌ ｄｎ ｕ ｅ， ｏ ｉｇｂ ｆ ｒ迅速进行 ０ ８ ａ ．％琼脂糖凝胶电泳。 １２ ２ 从单菌落制备质粒 ．． 转化后的平板 ３ ７℃倒置培养过 夜至单菌落 长至 ２～３ｍ 用无 菌小枪头挑 取上述对应 的 ４ ｍ， 个单菌落 ， 加入 １ Ｄ ％Ｓ Ｓ溶 液 ２ ， Ｏ 涡旋混 匀或者 用枪头 吹 打混匀 ， 室温放置 ２ｍｉ，２０ ０ｒｍ ｎ离心 ３ｍｎ 取上清 ； ｎ １ ０ ｉ ／ ｉ， 加 入 ４Ｉ Ｌ６×Ｄ Ａ ｌ ｄｎ ｕ ｅ ， ｘ Ｎ ａ ｉ ｂ ｒ迅速 进行 ０ ８ ｏ ｇ ｆ ． ％琼脂糖 凝胶
江 苏农业科 学 ２ １ ０ ２年第 ４ ０卷第 ６期
董冰雪， 玉英， 李 叶壮清 ， 等．一种快速 简便 高通量 筛选重组克 隆的方法［ ］ 江苏农业科学 ， １ ， （ ）４ — ２ Ｊ． ２ ２４ ６ ：１ ４ ０ ０
一 ４ ｌ一
一
种快速简便高通量筛选 重组 克隆 的方法
董 冰 雪 ，李玉英 ，叶壮 清 ， 三春 ，李运 会 ，宋雅 菲 ， 耿 刘
２Hale Waihona Puke １ 用大肠杆 菌培养液制备质粒 ．
购 白天根生化科 技（ 北京） 有限公司 ；Ｂ Ｔ Ｅ电泳缓冲液。 １２ １ 在大肠 杆菌培养液 中制 备质粒 从转化试 验的平板 ．． 上任意挑选 ３个 白色、 １个蓝 色克 隆接种 到 液体 【 Ｊ 养基 Ｂ培
从 图 １可以看出 ， 白色克 隆的质粒 迁移 速率 明显慢 ３个
菌液 ，２００ ｒｍｉ 心 ３ １ ０ ｎ离 ／ ０Ｓ收集细胞 ， 除尽 上清 ， 入 １ 加 ％ Ｓ Ｓ溶液 ２ ， Ｄ Ｏ 涡旋 混 匀或 者用 枪 头吹 打混 匀 ， 室温 放置
２ｍ ｎ １ ０ ｍｉ 心 ３ ｍｎ 取 上 清 ； 入 ４ ｉ ，２００ ｒ ｎ离 ／ ｉ， 加 ６×Ｄ Ａ Ｎ
循环 ；２℃延伸 ５ｍ ｎ Ｃ ７ ｉ。Ｐ Ｒ结束后 取 ５
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进行 电泳。剩余
的模板 ４℃放置 ３周不影响扩增效率 ， 可以 一 ０℃长期保存。 ２ 质 粒 Ｄ Ａ用 ０ ８ Ｎ ． ％琼 脂糖凝 胶 ， Ｐ Ｒ产 物 用 １ 琼 脂 糖 凝 胶 ， Ｃ ％ １×Ｔ Ｅ缓 冲 液 ， 流 保 持 Ｂ 电 ８ Ａ， ０ｍ 电泳 ０ ７ ．５～１ｈ 。电泳结束后用 溴化 乙锭 （ Ｂ 染 色 ， Ｅ） 紫外灯下拍照 。
于对照 ， 明 ３个 白色克隆很 可能都插 入了外源片段 ； 说 而且 ３ 个质粒在凝胶上的迁移速率有 明显 差异 ， 说明载体上 面插入
的ｃＮ Ｄ Ａ片 段 可 能 大 小 不 同 。
２２ 单茵落制备质粒 ．
收 稿 日期 ：０ １—１ ０ ２１ １— ３
从 图 ２可以看出 ， 该方法 同样适合 于从 单菌落制 备。只
电泳。
时间 ， 简化了操作 步骤 。但 是这些方 法要 么需 要不常见 的化 学试剂 或者特殊材 料 或者 成分复 杂 的裂解 液 ］要 么 ， 是使用毒 性强 的苯 酚／ 氯仿／ 异戊 醇 （ ５： ４： ） ， 的要 ２ ２ １ ｊ 有 用到耗时且相对 昂贵的 Ｐ Ｒ ， Ｃ 甚至是 昂贵的试剂盒 。笔 者介绍一种使用单一试剂一 步裂解检测重 组质粒 的方法 ， 该 方法简便 、 廉价 、 快速 、 可靠 、 重复性强 ， 适合于任何化试 验 也 中快速筛选重组质粒。
院高层次人才科研启 动费（ 编号 ： ２ １ ００ ） ｚ ０ １０ ７ 。 ｘ
作者简介 ： 董冰雪（ ９７ １７ 一）， ， 女 河南方城人 ， 博士 ， 讲师 ， 主要从事分 子酶学及酶工程方面研究 。Ｅ—ｍａ ：ｏ ｇｉｇｕ２０ ＠１３ ｃｍ。 ｉ ｄｎｂｎｘ ｅ０４ ６ ．ｏ ｌ
１ 材 料 与方 法
１１ 材料 ．
１２ ３ 制 备 Ｐ Ｒ模 板 ．． Ｃ
如 果 想 得 到该 外 源 基 因 ， 以 对 用 可
“ ．． ” １２ １ 或者 “ ． ． ” １２ ２ 中的方法得到 的裂解液适当稀释 （ 稀释 １ ２ ０～ ０倍 ） 用作模板 ， ， 扩增 出 目的基 因。１ ， Ｃ ５ ｐ Ｐ Ｒ反应体 Ｌ 系含有 上下游 引物各 ０ ５ｐ ｏ ， 释后 的裂解 液 １Ｉ ， ． ｍ ｌ ／ 稀 ｘ Ｌ ２×Ｔ ｑｍ ｓ ｒ ｉ ｕｅ７ ５ Ｌ Ｃ ａ ａｔ ｘ ｒ ． 。Ｐ Ｒ扩增 程序 ：５℃预 变性 ｅｍ ｔ ９ ５ｍ ｎ９ ｉ；５℃变性 ３ ，４℃退火 ４ ，２℃延伸 １５ｍｎ３ ０Ｓ５ ５Ｓ７ ． ｉ， ０个
方法才能完成筛选 ， 因而需要建立一个快速 、 简便提取大量重 组 质粒 的方法 。尽管 目前存在着不少制备质粒 Ｄ Ａ的方 法 ， Ｎ 它们主要 由经典 的 Ｓ Ｓ一碱裂解法 …发展 而来 ， Ｄ 但是从操 作 时间、 Ｎ Ｄ Ａ质量、 本等方 面都存在 缺点 。碱 裂解 法 因可靠 成 性 强而被普遍接受 ， 整个操作繁琐 、 但 费时 ， 提取 １ ２个样品通 常要 ９ ０—１０ｍｉ。为了缩 短操作 时间、 高工作效 率 ， ２ ｎ 提 近年
（ 阳师 范学院生命科学与技术学院 ， 南 河南南阳 ４ ３６ ） ７０ １
伟
摘要： 介绍 了一种极其简单 、 快速 、 廉价 、 可靠 的从 ｃ Ｎ Ｄ Ａ文 库或者 转化平板 上高通 量筛选 重组质粒 的方法 。将 细 菌培养液或者转化平板上的单菌落直接用 １ Ｄ 一 步裂解 ， ％Ｓ Ｓ 琼脂糖凝胶快速 电泳 ， 据 Ｄ Ａ迁移速率判断是否重 根 Ｎ 组质粒 。裂解上 清液 可以稀释后直接用作 Ｐ Ｒ模板 ， Ｃ 扩增 出 目的基 因。利用这种方法可 以在 短短的几个 小时 内完成
上 ，７℃摇 床培养 至静止期 （ ３ Ｄ
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重组克隆的方法就愈显迫切 。蓝 白反应（ ａ Ｌ ｃｚ的 互补 ） 使 许多插入外 源片段 的重组 质粒很容 易筛选 出来 ， 但是 在许多
情 况 下 重组 质 粒 不 含 有 筛 选 标 记 ， 须 通 过 提 质 粒 跑 电 泳 的 必
基金项 目： 河南省科 技攻关 计划 （ 编号 ： １ １２ １３ ５ ； 阳师范学 １２ ０ ２０ ８ ） 南
是菌落要长到 ２～ ３ｍｍ， 菌落太小则质粒条带不明显 ； 裂解时
间不宜过长 ， 间过 长会 使裂解液黏稠 ， 时 增加点样难度 ， 如果 裂解时间过 长， 裂解液变黏稠 ， 点样速度要慢 ， 以免 Ｄ Ａ从点 Ｎ 样孔 中跑出来。