激光扫描共聚焦显微镜 PPT课件

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Membrane potential
Esterase activity
Membrane permeant
Excitation (nm) 535 450 493 507 492 488
Emission (nm) 617
580-660 516 529 517
509
三、激光扫描共聚焦显微镜
3.1 激光扫描共聚焦显微镜的组成
4.3 微生物的群落分析
1、环境中微生物的分布及活性的原位分析(光学切片 功能)
2、食品污染分析
4.4 共聚焦显微镜的其它相关的研究
1、荧光原位杂交研究(In situ hybridization) 2、生物膜的研究(bioflim) 3、细菌在植物根部的定植研究 4、细菌的活性分析 5、抗菌分析
荧光染料作为底物由酯酶所水解产产生荧光分子
CFDA-SE
CFDA-SE
活性微生物细胞
பைடு நூலகம்
活性微生物细胞将其还原为荧光分子并沉淀于 微生物细胞内
4、膜电位(membrane potential)
工作原理:活性微生物细胞可维持细胞的膜电位, 可作为微生物细胞活性的一个评价的生理指标
1. 带正电荷荧光探针 Rhodamine 123 (Rh123); DiOC6(3) 进入活性细胞
• 2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium bromide (INT)
CTF
CTC的微生物细胞还原 无色非荧光分子 红色荧光分子
CTC CTF
Viable cell
Example 2: Staining of Streptomyces sp. with CTC
1、膜通透性(membrane integrity)
BacLight Live/Dead (PI/SYTO9)
PI
SYTO9
PI
PI
PI
PI SYTO9
SYTO9 PI
SYTO9 PI
PI
PI PI
PI SYTO9
Viable cell
Damaged cell
Example 1. Staining of Streptomyces sp. with BacLight live/dead L7007
一、分子荧光的产生
1.1 分子荧光产生的条件
1. 基态分子受到能量激发,吸收一定能量后,跃迁至 激发态, 通常为π→π*、n→π*跃迁
2. 激发态分子在很短时间内,以电磁辐射的形式释放 能量并返回基态,便产生了分子发光(荧光或磷光)
1.2 影响荧光的因素
1. 溶剂的影响
除一般溶剂效应外,溶剂的极性、氢键、配位键 的形成都将使化合物的荧光发生变化
Fluorescent microscopy
Confocal microscopy
显示的是一个光学切面
Fluorescent microscopy
样品的3D-重建
激光扫描共聚焦显微镜主要功能
1、荧光定性 2、荧光定量 3、动态荧光监测 4、断层扫描 5、三维重构 6、共聚焦图像分析 7、荧光显微切割
四、激光扫描共聚焦显微镜在微生物研 究中的应用
4.1 共聚焦在链霉菌研究中的应用
1、发育分化的研究 2、内部结构及活性研究 3、菌体大小测量 4、产物合成的研究
链霉菌Streptomyces antibioticus 的生长分化
4.2 共聚焦在真菌研究中的应用
1、真菌浸染机制的研究 2、真菌发育分化的研究 3、真菌生长的研究 4、真菌活性的研究(FDA/PI) 5、真菌的原位研究 6、真菌细胞融合的研究 7、一些机制的研究,如胞吞等
实验:激光扫描共聚焦显微基本步骤
1、选择荧光探针:主要依据实验目的,选择好荧光探 针,目前,荧光探针的种类已经成千上万,人们可 以根据所研究问题的不同,选择不同的荧光探针。
2、样品染色:染色时间长短与染料及微生物有关,短 的几分钟
3、制片:与普通显微镜类似,制片后尽快观察
4、上机观察:仪器参数设置
感谢您的关注! 欢迎相互交流!
激光扫描共聚焦显微镜在微 生物研究中的应用
刘盛荣 2011-09-09
激光扫描共聚焦显微成像
CTC 染色
Baclight Live/Dead 染色
Baclight Live/Dead 染色
主要内容
1、分子荧光的形成 2、微生物研究中常用的荧光染料 3、共聚焦显微镜基本原理 4、共聚焦显微镜在微生物研究中的应用
3. Optical Sectioning of Objects Without Physical Contact (光学切片)
4. Three-Dimensional Reconstruction of Specimen (三维重构)
5. Improved Resolution(更高的分辨率)
Example 3: Comparison of confocal microscopy with fluorescent microscopy
链霉菌不同发酵时期:菌丝活性及内部结构
2、代谢活性(metabolic activity)
微生物代谢活性分析的荧光探针主要有:
• 5-Cyano-2.3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)
• 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2tetrazolium bromide (MTT)
显微镜光学系统 扫描装置 激光光源 检测系统
整套仪器由计算机控制,各部件之间的操作切换都 可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
3.2 共聚焦成像原理
3.3 激光扫描共聚焦显微镜与荧光显微镜比较 1. More Color Possibilities
2. Less Cross Talk(串色)
2. 带负电荷荧光探针 Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine oxonol
DiBAC4(3) 进入死细胞
5、pH荧光探针
工作原理:活性细胞可以维持胞内外一个合适的pH 梯度,因此,测定微生物细胞内的pH可作为细胞 生理状态的一个评价标准
1. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)
2. 温度的影响
荧光强度对温度变化敏感,温度增加,外转换去 活的几率增加
3. 溶液pH
对酸碱化合物,溶液pH的影响较大,需要严格 控制
二、微生物研究中常用的荧光探针
荧光探针主要基于测定微生物的某一生理进行分类
微生物研究中主要的荧光探针:
1、膜通透性(membrane integrity) 2、代谢活性(metabolic activity) 3、膜电位(membrane potential) 4、酯酶活性(esterase activity) 5、pH 梯度(pH gradient) 6、其它
CTC 染色
CTC 染色
3、酯酶活性(esterase activity)
工作原理:在活性微生物细胞酯酶作用下,将非荧 光分子水解,释放出荧光分子并依靠膜的完整性保 留于胞内
1. Fluorescein diacetate (FDA)
2. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)
2. Pranine
3. BCECF
一些常见荧光染料的激发与发射波长
Probe
PI
CTC
DiBAC4(3) Rh123
FDA CFDA-SE SYTO9
Physiological function
Membrane integrity
Metabolic activity
Membrane potential
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