6分子生物学研究法(下)

主要内容
基因表达研究技术 基因敲除技术 蛋白质及RNA相互作用技术
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基因芯片及数据分析 利用酵母鉴定靶基因功能 其他分子生物学技术
6. 1 基因表达研究技术
基因表达系列分析技术 RNA的选择性剪接技术
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原位杂交技术 基因定点突变
6.1.1 基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）
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仅能编码80000种转录物，所以理论上每一个9碱基标签 能够代表一种转录物的特征序列。 第二，将具有基因特异性的9碱基标签集中(连接)于一 个克隆载体中进行测序，就可以得到代表基因表达的标 签，标签的种类代表不同的转录物，而标签重复出现的 次数代表该转录物的拷贝数，即基因表达的丰度。
z (1) 生物素蛋白-dT为引物反转录 cDNA，限制性酶(锚定酶，AE)酶切。 每一个mRNA只收集其polyA尾与最 近的酶切位点之间的片段。
负对照，mRNA的 同义链, 无杂交 信号。
其次，SAGE可用于定量比较不同状态下的组
织细胞的特异基因表达。利用SAGE 技术分 析正常乳腺上皮细胞、原位癌、浸润癌和转 移癌基因表达的差异。1 通过比较,寻找正常 乳腺上皮细胞高表达,而在肿瘤细胞中却表 达消失的基因。
基因表达系列分析技术
RNA的选择性剪接技术
原位杂交技术
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基因定点突变
6. 1. 2 RNA的选择性剪接技术
RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方 式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接 异构体的过程。包括：1
平衡剪接、5’选择性剪接、3’选择性剪接、 外显子遗漏型剪接及相互排斥性剪接。
(a)平衡剪接 (b)5’选择性剪接 (c)3’选择性剪接 (d)外显子遗漏型剪接 (e)相互排斥性剪接
第六章 分子生物学基本研究法
（下）基因功能研究技术
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前言
从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速 发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因 操作和基因工程技术的进步。
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基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核 酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列 分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增 等，是分子生物学研究的核心技术。
选择型外显子
组成型外显子
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选择性剪接的不同类型
选择性剪接检测方法
RT-PCR 是一种检测基因是否存在选择性剪 剪接的比较简单的方法。
通过PCR 克隆不同组织来源的RNA样品全 长基因，电泳检测产1物的大小，测序检测 PCR产物是否存在差异，可以进行初步鉴定 是否具有选择性剪接，还可以初步鉴定有几 个剪接体，通过测序可以精确鉴定外显子的 剪接情况。
RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高 辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定 的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补 的mRNA分子，两者杂1 交产生双链RNA，可 通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析。
组织原位杂交检测棉花纤维特异基因的表达
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mRNA 的 互 补 链 ， 杂交信号集中于 纤维细胞中。
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共351个，占7.6%；④ 仅出现过一次共840个，占41.8%。 所以SAGE能够快速、全范围提取生物体基因表达信息，对 已知基因进行量化分析。
SAGE也能应用于寻找新基因。虽然SAGE的标签仅包括9个 碱基，但加上锚定酶的位点序列(4个碱基)共可确认13碱基 序列。如果一个标签检索已知序列时没有同源序列组解剖计划(cancer genome anatomy project , CGAP) 的进行,有数万个转录 物标签从100 多种人类细胞中获得。SAGE 被广 泛用于分析正常组织和癌症组织基因表达谱。
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CGAP SAGE 计划建立了SAGE 数据库网站 (/SAGE) ,可以分析代表某 条基因名称的SAGE 标签表达水平。
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SAGE的应用
SAGE可应用于人类基因组研究。1995年 Velculescu 等使用 计算机对9碱基标签数据进行分析并对GenBank检索。在分 析的1000个标签中，95%以上的标签能够代表唯一的转录 物。转录水平依标签出现频率分为4类：①超过三次 共380 个，占45.2%；② 出现三次 共45个，占5.4%；③ 出现两次
是以DNA序列测定为基础，定量分析全基因组 表达模式的技术，能直接读出任何一种细胞或 组织的基因表达信息。1
SAGE技术是在1995年由Velculescu等人提出并 首先发表在《Science》杂志。
SAGE的原理
第一，在转录水平上，任何一个cDNA片段上9～10碱 基的短核苷酸序列标签（Tag）就足以代表一种特异性 （专一）的转录产物(基因)。因为，一个9碱基顺序能 够分辨262144个不同的转录物(49)，而人类基因组估计
z (2)将cDNA等分为A和B两部分，分 别连上连接子1或连接子2。
z (3) 标签酶TE酶切，混合并连接两个 1 短cDNA片段，构成双标签后，以引
物A和B扩增。 z (4) 用标签数据进行处理。在所测序 列中的每个标签间以锚定酶序列间 隔，如图中锚定酶以CATG/GTAC序 列确定标签。
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图6-3 RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基 因的选择性剪切
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图6-4 果蝇（Drosophila melanogaster）的Dscam基因
可以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体
基因表达系列分析技术
RNA的选择性剪接技术
原位杂交技术
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基因定点突变
6. 1. 3 原位杂交技术 原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射 检测体系，在组织、细1 胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手 段，通过分为RNA和染色体原位杂交两大类。