细菌内毒素的简介

4.4 细菌内毒素检查用水的要求提高，内毒 素含量降到了0.015EU/ml，光度测定法用 细菌内毒素检查用水的内毒素含量小于 0.005EU/ml。 4.5增加了供试品溶液的制备这一项，明确 了供试品溶液的PH 值在6.0~8.0范围内， 配制酸、碱及缓冲盐的容器应去除内毒素， 水用细菌内毒素检查用水。 4.6鲎试剂灵敏度的定义有所改变 2000年版的定义是：在本检查法规定的条 件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶 液中的最低内毒素浓度；
2 有关术语及相关内容
2.1热原反应—病人在静脉输注药剂后可能发生的发热、冷 感、寒颤、恶心、呕吐、头痛、腰及四肢关节痛、肤色灰白、 白细胞下降、血管通透性增强、昏迷、休克、死亡等一系列 症状称为热原反应。 2.2 热原—所有能引起热原反应的物质称为热原。药品中的 热原主要是细菌内毒素。一般可以认为：细菌内毒素是热原， 但热原不等于细菌内毒素。 2.3细菌内毒素检查法—2005年版中国药典定义为：系利用 鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以 判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。 2.4鲎试剂—我国生产的鲎试剂系鲎科动物东方鲎的血液变 形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，用于细菌内毒素检查。 根据检查方法分为凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂；根据鲎试 剂与内毒素反应的专一程度分为普通鲎试剂和特异性鲎试剂。 特异性鲎试剂是专一对内毒素反应的鲎试剂。鲎试剂灵敏度 用符号λ表示，单位用EU/ml表示。 2.5鲎– 鲎是一种栖生于海洋的低等无脊椎动物，出现在古代 泥盆纪，现存于世的有三属四种，常见的有两种，美洲鲎和 东方鲎
检测2.0λ、λ 检测2.0λ、λ、 0.5λ、0.25λ的 0.5λ、0.25λ 的内毒素平行4 内毒素平行4 组，同时做4管 组，同时做2 阴性，最高浓 管阴性，最大 度的4管均为阳 浓度2.0λ的4 性，最低浓度 管均为阳性， 最低浓度 的4管均为阴性。 0.25λ的4管均 S 标准差 为阴性 X 4个连续内毒 NC均为阴性 素稀释液最低 λc=lg-1(Σx/4) 阳性结果浓度 的对数值。 λ在
核心寡聚糖分为内核和外核。外核 由数种己糖组成，内核含有庚糖特 殊的酮糖，这部分结构对不同菌株 的LPS基本相似。类脂A是LPS的 毒性及生物活性中心。典型的类脂 A含有一个以β1’，6-糖苷键相连的 D-氨基葡萄糖双糖组成的基本骨架， 双糖骨架的游离羟基及氨基可携带 长链脂肪酸和磷酸基团。不同种属 细菌合成的类脂A的分子组成及其 骨架上的取代基团性质有差异。
4中国药典2005年版细菌内毒素检查法的修订内容
中国药典2005年版较中国药典 2000年版有重大修订，主要修订 内容如下： 4.1.定义改变：2005年版药典定义 细菌内毒素检查法为利用鲎试剂来 检测或量化由革兰氏阴性菌产生的 细菌内毒素，以判断供试品中细菌 内毒素的限量是否符合规定。
4中国药典2005年版细菌内毒素检查法 的修订内容
结果判断
PC为阳性 PC为阳性 PC为阳性 NC为阴性 PPC为阳性 PPC为阳性 NC为阴性 NC为阴性 样品均为阴性， 合格 样品均为阴性， 样品均为阴性， 合格 合格 鲎试剂灵敏度 无热原注射用 细菌内毒素检 0.25EU/ml 水0.05EU/ml 查用水内毒素 含量小于 供试品细菌内 为浸提介质 0.015EU/ml 毒素限量不超 过0.5EU/ml 样品溶液不稀 释，当结果出 现阳性时， 1→2稀释，4 支，1支阳，
1.3 供试品检查时，阴性对照、阳性对照、 和供试品阳性对照必须同时进行，否则结 果无效。 2试验材料及用具 天平、电热干燥箱（180~300℃ ）、恒温 水浴箱（37± 1 ℃）、漩涡混合器、鲎试 剂(应具有国家主管部门的批准文号）、细 菌内毒素工作品、细菌内毒素检查用水； 其他试验用具如移液枪、封口膜、一次性 安剖等。
除热原 程序
鲎试剂灵 敏度复核
检测能出现阳性 结果阴性结果的 4个连续2倍等比 稀释液，平行4 管，37±1℃保 温60±2min,最 高浓度的4管均 为阳性，最低浓 度的4管均为阴 性。按公式计算
Σ x2 Σ x 4 3
2
当s＜0.365时按 λ=log-1(Σx/4) 计算鲎试剂的灵 敏度；s≥0.365 时，测定无效。
检 查 法
供试品至少3个 浸提介质：内毒素 含量＜0.05EU/ml 输液器10ml,输血 器15ml,反复荡洗 5次后两端密闭， 37 ℃2h后合并 2支NC, 2支PC, 2支供试品。
样品稀释到MVD， 1支NC, 1支PC,1支 PPC 2支供试品。
样品稀释到MVD， 2支NC, 2支PC,2支PPC 2支供试品。
0.5λ~2.0λ间 有效
干 扰 试 验
未涉及
比较鲎试剂在水中 和样品中的灵敏度， 各平行4组，结果Es、 Et均应0.5λ~2.0λ之 间，样品的稀释不 大于MVD,3个批号
比较鲎试剂在水中和样 品中的灵敏度，各平行 4组，结果Es、Et均应 0.5λ~2.0λ之间，样品的 稀释不大于MVD,3个批 号 2个以上厂家的鲎试剂
其他
三、试验操作
1.简述 1.1 鲎试剂灵敏度复核项的目的不仅是考察 鲎试剂灵敏度和细菌内毒素工作标准品的 效价是否准确，也是考察检验人员操作方 法是否正确和试验条件是否符合规定。因 此每个实验室再将一批新的鲎试剂用于试 验前应进行鲎试剂灵敏度复核项试验。 1.2干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素 检查方法以及供试品阳性对照结果呈阴性 时确定供试品是否存在抑制作用。
1.2 细菌内毒素在我国的发展
在我国，1975年开始鲎试剂的研制，1979年开始 将其用于放射性药品的细菌内毒素检查方法研究， 1983年开始用于输液制剂热原检查的协作研究。 1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许4种 药品采用细菌内毒素检查法作为热原检查的初试 方法；1993年中国药典1990年版第二增补本开始 收载细菌内毒素检查法。1995年版中国药典规定 13个品种进行细菌内毒素检查法。2000年版药典 规定60个品种进行细菌内毒素检查法。2005年版 药典规定133个品种进行细菌内毒素检查法。
2.6细菌内毒素—是革兰氏阴性菌的细胞外 壁层上的特有结构，即脂多糖，具有广泛 的生物活性，以致热居首。其量值以国际 单位（IU)或内毒素单位（EU)表示，现规 定1 IU=1 EU。 2.7细菌外毒素与细菌内毒素 细菌外毒素是一种由活菌合成并释放出来， 对热敏感的蛋白质。 细菌内毒素是一种对热抵抗，且只有当 菌体死亡裂解或人工破碎后方可释放来。
外毒素与内毒素的主要区别
区别要点 外毒素 内毒素
来源
存在不位 化学成分 稳定性 毒性作用
G+、部分G胞浆内合成分泌至菌体外 蛋白质 不稳定，60-80℃破坏 强，有选择性
G细胞壁成分 脂多糖 160-240℃破坏 弱
抗原性
举例
强，可制成类毒素
肉毒毒素，白喉外毒素
弱
大肠杆菌内毒素
内毒素的主要生物活性： 1 发热反应 2 白细胞反应 3 代谢性酸中毒 4 感染性休克 5 弥漫性血管内凝血（DIC) 2.8细菌内毒素标准品 细菌内毒素标准品分为细菌内毒素国际标准 品、国家标准品和工作标准品。 在我国，细菌内毒素国家标准品系自大肠杆 菌提取精制得到的内毒素。
3.2细菌内毒素的量值 1996年WHO建立第二批国际内毒素标准 品(94/580，10000IU),规定1IU=1EU。 我国国家标准品981是用IS2为基准标定的 我国第6批国家标准品。每支含内毒素 9000EU。 3.3 细菌内毒素的限值 供试品细菌内毒素限值按一下公式确定 L=K/M，式中L为供试品内毒素限值，以 EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K为按给药途 径，临床无任何不良反应的内毒素阈剂量， 以EU/kg表示，注射剂K=5EU/kg/hr。M为 人用最大剂量，以 ml/kg/hr,mg/kg/hr,U/kg/hr表示，中国人均
2005年版的定义是：在本检查法规定的条 件下使鲎试剂产生凝聚的最低内毒素浓度 4.7.把原来的凝胶法细分为凝胶限量试验和凝 胶半定量试验。 4.8.凝胶限量试验中，阴性对照和阳性对照的 平行管数都增加为2支。 4.9.增加了凝胶半定量试验，通过确定反应终 点浓度来量化供试品中内毒素的含量。 4.10.较详细讲述了光度测定法的方法。
细菌内毒素检查法在药品和医 疗器械检查中的应用
细菌内毒素检查
本讲座共分三部分 一、基础部分 二、标准部分 三、实验操作部分
一、基础部分
1. 前言 防止输注用药品及器械的热原污染，是临床上十分重 要的。半个多世纪以来，热原检查法对保证注射用药品安 全发挥了重要作用。但随着制药工业的发展，该方法已不 完全适合许多品种的热原检查。为此，人们研究了一种替 代热原检查法的方法，这就是我们今天正在研究和扩大应 用的细菌内毒素检查法。细菌内毒素检查是输注药品及器 械质量控制中的一项重要指标。 1.1细菌内毒素检查法 1885年美国的W.H.Howell发表了一篇有关鲎血的化学 组成和凝集方面的研究成果，这可以说是鲎试验历史的开 端。1956年，美国动物学家F.Bang发表论文《鲎的一种 细菌性疾病》，阐明了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。19 64年F.Bang和J.Levin提出了鲎血凝集的初步机理，1968 年正式建立鲎试验（Limulus test,LT)方法。 1980年USP20版；1987年欧洲药典、1989年英国药 典1989增补本、1988年日本药典第11增补本、1993年中 国药典1990年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。
3.凝胶实验技术 3.1凝胶法的实验程序 1试验准备：试剂、仪器及用具等 2 确定药品的细菌内毒素限值L 3选择鲎试剂的灵敏度λ 4 计算供试品的最大有效稀释倍数或最小有 效浓度 5 鲎试剂灵敏度复核 6 药品与鲎试剂相容性的初筛试验 7 供试品干扰试验 8 干扰试验的验证 9 供试品日常的内毒素限量检查
法规 医用输液、输血 生物材料和 中国药典 项目 注射器BET 医疗器械BET 2005年BET
玻璃器具180℃ 干烤2h获250℃ 30min,塑料器具 30%双氧水4h， 无热原水冲洗后 60 ℃烘干。 250 ℃至少30 Min,或180 ℃ 至少2h,也可 用其他适宜的 方法。 250 ℃至少 1h 也可用其他 适宜的方法， 并应确证不 干扰BET的检 查

1996年WHO 建立第二批国际内毒素标准 品（94/580，10000IU），规定1IU=IEU。 981是用IS2为基准标定的我国第6批国家标 准品，共生产8批。 细菌内毒素工作品分为冻干品和液体两种 剂型，均可用于鲎试剂复核、干扰试验和 实验中的阳性对照。本品为一次性使用。
2.9细菌内毒素检查用水 2005年版中国药典规定细菌内毒素检查用 水系指与灵敏度0.015EU/ml或更高灵敏度 的鲎试剂24h不产生凝集反应的灭菌注射用 水。 3 细菌内毒素的化学结构、量值和限值 3.1化学结构 细菌内毒素的本质是脂多糖（LPS)，主要 有两部分组成：多糖和类脂A。多糖部分又 可进一步分为O-特异性多糖链、核心寡聚 糖。O-特异性脂多糖一般由3-6个单糖通过 糖苷键相联形成低聚糖单位聚集而成，是 LPS分子中最易变异的成分。
二、标准部分
2.1 细菌内毒素检查法 （中国药典2005年版） 2.2 医用输液、输血、注射器细菌内毒素检 查法GB/T14233.2-93 2.3生物材料和医疗器材的细菌内毒素检查法 （卫生部药政局1997年药发[1997]第81号 ）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法 生物材料和医疗器械的细菌内毒素检查法 与中国药典2005 年版的比较
2000年版定义为：利用鲎试剂与细菌内毒 素产生凝集反应的机理，以判断供试品中 细菌内毒素的限量是否符合规定。 4.2. 把中国药典2000年版的细菌内毒素检查 法应用指导原则，合并入附录ⅪE细菌内毒 素检查法。 4.3.明确了细菌内毒素检查有两种方法：凝胶 法和光度测定法，供试品检测时，可用其 中任意一种方法进行试验，只有当测定结 果有争议时，以凝胶法结果为准。