3.0 蛋白质化学

② 与甲醛的反应
用NaOH滴定
★氨基酸甲醛滴定法(概念) ●判断蛋白质水解或合成的进度
③ 与2,4-二硝基氟苯（DNFB）的反应 －－烃基化反应
2，4-二硝基苯氨基酸，黄色 （DNP-氨基酸，可用乙酸乙酯或乙醚抽提）
多肽或蛋白质N端氨基酸的α-氨基也能与 DNFB反应，生成DNP-多肽或DNP-蛋白质。后 者用酸水解时，所有肽键被打开，可得到黄色的 DNP-氨基酸。 该反应由F. Sanger（英）首先发现，并用于 鉴定多肽或蛋白质的N-端氨基酸，阐明了胰岛素 的一级结构。（故DNFB亦称作Sanger试剂） －－蛋白质N端氨基酸测定的方法之一
pH=pKa +lg[质子受体]/[质子供体]
（1）等电点的概念
R CH NH3+ R + OH+ H+ (pK´1) CH NH3 COO
+
+
OH-
R
COOH
+ H+ (pK´2)
CH NH2 COO
pH< pI
净电荷为正
pH = pI
净电荷=0
pH > pI
净电荷为负
在一定pH条件下, 氨基酸分子中所带的正电荷数和负 电荷数相等, 即净电荷为零, 在电场中既不向阳极也不向阴 极 移 动 , 此 时 溶 液 的 pH 值 称 为 该 种 氨 基 酸 的 等 电 点 (isoelectric point，pI )。 －－氨基酸的等电点是它呈现电中性时所处环境的pH值.
第一章 蛋白质化学
肌红蛋白
血红蛋白
蛋白质折叠的自由能漏斗
蛋白质 ( protein ) 是由许多不同的α-氨 基酸按一定的序列通过酰胺键（蛋白质化学
中专称为肽键）缩合而成的，具有较稳定的
构象并具有一定生物功能的生物大分子
第一节 蛋白质的化学组成与分类
一、蛋白质的元素组成 C 50％ ～ 55% H 6 ％ ～ 8％ O 20％ ～ 23％ N 15% ～ 18% S 0% ～ 4% 有些还含微量的P, Fe, Zn, Cu, Mo, I 等元素. N含量在各种蛋白质中比较接近, 平均为16% 1g 氮相当于 6.25g 的蛋白质 ( 6.25常称为蛋白质系数 ) 一般含:
味，甜味最强的是D-色氨酸，可达蔗糖的40倍；L-氨 基酸有甜、苦、鲜、酸四种不同味感。)
氨基酸在水中的溶解度差别很大, 除胱氨酸、 半胱氨酸和酪氨酸外, 一般都能溶于水, 并能溶 解于稀酸或稀碱中, 但不能溶解于有机溶剂 ( 通 常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出 )。 脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇或乙醚中, 且二者极易溶于水而潮解。
3个有个性的氨基酸
1）脯氨酸（Pro） 因为是一个环 状的亚氨基酸, 它的氨基和其它氨 基酸的羧基形成的肽键有明显的 特点, 较易变成顺式肽键. 2）甘氨酸（Gly） 是唯一的在α-碳 原子上只有2个氢原子, 没有侧链 的氨基酸. 为此它既不能和其它残 基的侧链相互作用，也不产生任 何位阻现象, 进而在蛋白质的立体 结构形成中有其特定的作用.
二氨基一羧基ＡＡ(Lys、His、Arg)
一氨基二羧基ＡＡ(Glu、Asp)
第四节 氨基酸的重要理化性质和功能
一、氨基酸的性质 （一）一般物理性质 α-氨基酸为无色晶体，熔点极高(一般在 200℃以上)。有的无味、有的味甜、有的味苦、 谷氨酸的单钠盐有鲜味(味精的主要成分)。 (氨基酸的味感与其立体构型有关。D-氨基酸多带有甜
（2）氨基酸等电点的计算
pK´1 + pK´2
氨基酸的pI可由其分子上解离基团的解离常数来确定。 一氨基一羧基AA 的等电点计算：
pI =
2
pK´
cooH +
一氨基二羧基AA 的等电点计算： 二氨基一羧基AA 的等电点计算：
pI =
pI =
pK´R pK´R
2
pK´
NH2 +
2
可见，氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性 离子两侧的基团pK′值之和的二分之一。
氨基酸侧链的疏水度
侧 链 疏 水 度 －0.8 －0.9 －1.3 －3.2 －3.5 －3.5 －3.5 －3.5 －3.9 －4.5 4.5 4.2 3.8 2.8 2.5 1.9 1.8 1.6 －0.4 －0.7 Ser Trp Tyr His Glu Gln Asp Asn Lys Arg
(CH2) 4
＋
(CH2) 4
＋
NH3
＋＋
K1'
NH3
K2'
＋
NH3
K3'
±
Lys
Lys
Lys
溶液 pH 值增大
Lys
－
pI = 1/2 ( pK2' + pK3' )
二氨基一羧氨基酸的等电点的计算, 以Lys为例：
（3）等电点理论的应用
A. 等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀。 利用该性质可分离制备某些氨基酸。例如谷氨 酸的生产，即将微生物发酵液的pH值调至3.22 （谷氨酸的等电点）而使谷氨酸沉淀析出。
极性R基AA
带电荷 据R基团化 学结构分类 脂肪族ＡA 芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp) 杂环ＡＡ(His、Pro、Trp) 必需ＡＡ 非必需ＡＡ 一氨基一羧基ＡＡ
带正电荷（３种）
带负电荷（２种）
人体必需氨基酸
据营养 学分类
Lys Val Ile
Trp Met Thr
Phe Leu
据氨基、羧 基数分类
二、氨基酸 (amino acid) 的结构通式
－－蛋白质是由20种基本氨基酸组成的
除脯氨酸（亚氨基酸）外，其他19种均具有 如下结构通式：
不变部分
侧链，可变部分


除脯氨酸外，均为α-氨基酸 除甘氨酸外，均为手性氨基酸 除胱氨酸和酪氨酸外，其余AA都能溶于水。
什么是α-氨基酸？

----C-C-C-C-COOH
该反应使氨基酸的氨基被活化
② 脱羧基反应
③ 蛋白质合成的氨基酸活化反应
（2）α-氨基参加的反应 ① 与亚硝酸的反应
NH2 室温 R-CH-COOH + HNO2
OH R-CH-COOH + N2 + H2O
在标准条件下测定生成的N2体积，即可计算 出氨基酸的量。 用途：是范斯莱克（Van Slyke）法测定氨基氮的 基础, 可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定
2. 碱水解 方法：一般用5 mol/L NaOH 煮沸10 ～ 20 h。 优点：色氨酸在水解中不受破坏。 缺点：多数氨基酸受到不同程度的破坏，产生 消旋现象，得到的是D-和L-氨基酸的混 合物。此外，引起精氨酸脱氨（生成鸟 氨酸和尿素）。
3. 酶水解 方法：用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（或称 蛋白酶, proteinase）已有十多种，常用 的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（或称糜 蛋白酶）及胃蛋白酶等。 优点：不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。 缺点：使用一种酶往往水解不彻底，需几种酶协 同作用才能使蛋白质完全水解。该法主要 用于部分水解。
5-二甲氨基萘磺酰氯( 简称丹磺酰氯或DNS-Cl ) 代替DNFB试剂
酰化试剂
5-二甲氨基萘磺酰氨基酸有强烈的荧光， 可用荧光光度计快速检出，灵敏度高。
疏 水 度
（三）氨基酸的化学反应 氨基酸是离子化合物，但在溶液状态时，存在 下列平衡：
化学反应中可用左边的结构式表示氨基酸。 氨基酸分子的α-氨基、α-羧基均能参加反应， 有的侧链R基团也能参加反应。
（1）α-羧基参加的反应 ① 成盐、成酯、成酰氯和成酰胺反应 氨基酸与碱作用即生成盐。 氨基酸的羧基被醇酯化，形成相应的酯。
γ β α

----C-C-C-C(NH2)-COOH
α-氨基酸

----C-C-C(NH2)-C-COOH
β-氨基酸
----C-C(NH2)-C-C-COOH
γ-氨基酸
三、氨基酸的分类
（一）按R基的化学结构分类 可分为三类：脂肪族、芳香族和杂环族 1、脂肪族氨基酸（15种）
●
含一氨基一羧基的中性氨基酸（5种）
一氨基一羧基AA的等电点计算，以丙氨酸为例:
一氨基二羧基氨基酸等电点的计算, 以Glu为例:
等电点的计算
例 Lys 的pI 计算
COOH CH－NH3
＋
COO
－ H+ ＋H +
－
COO－
－ H+ ＋H +
COO－
－ H+ ＋H +
CH－NH3
＋
CH－NH2 (CH2) 4
＋
CH－NH2 (CH2) 4 NH2
天冬氨酸 (Asp, D)
谷氨酸 (Glu, E)
天冬酰胺 (Asn, N)
谷氨酰胺 (Gln, Q)
●●●●
碱性氨基酸(二氨基一羧基)（2种）
杂环
赖氨酸 (Lys, K)
精氨酸 (Arg, R)
组氨酸 (His, H)
2、芳香族氨基酸（3种）
苯丙氨酸 （Phe,F）
酪氨酸 （Tyr,Y）
色氨酸 （Trp,W）
（二）氨基酸的解离 1、两性解离和等电点 两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有能 放出质子的 -NH3+正离子和能接受质子的 -COO负离子。 氨基酸是两性电解质。
R CH NH3+
R + OH+ H+ CH NH3 COO
+
+
OH-
R
COOH
+ H+
CH NH2 COO

Handerson-hasselbalch
3）半胱氨酸(Cys) 它的个性不仅表现在其侧链 有一定的大小和具有高度的化学反应活性，还 在于两个 Cys 能形成稳定的带有二硫（桥）键 的胱氨酸。二硫键不仅可以在肽链内，也可以 在肽链间存在。更有甚者，同样的一对二硫键 能具有不同的空间取向。
二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号
非极性R基AA（８种） 据R基团 极性分类 不带电荷（７种）
清蛋白 二、蛋白质的分类 球蛋白 谷醇溶蛋白 谷蛋白 简单蛋白 鱼精蛋白 （按溶解度） 组蛋白 硬蛋白
1. 化学成分
缀合蛋白 （按辅基）
核蛋白 糖蛋白 脂蛋白 金属蛋白 磷蛋白 血红素蛋白 黄素蛋白
酶 调节蛋白
转运蛋白 贮存蛋白 2. 蛋白质功能 保护蛋白 收缩和游动蛋白 结构蛋白 支架蛋白
球状蛋白 3. 蛋白质形状 纤维状蛋白
B. 利用各种氨基酸的等电点不同，可通过电泳法、 离子交换法等在实验室或工业生产上进行混合 氨基酸的分离或制备。
2、R基团的疏水性
氨基酸的疏水性直接影响到蛋白质的折叠。－－在 水溶液中，这是驱动蛋白质分子折叠的动力之一。 表
侧 链 Ile Val Leu Phe Cys Met Ala Pro Gly Thr
蛋白质平均含N量为16％,这是凯氏定氮法
测定蛋白质含量的理论依据：
蛋白质含量＝蛋白氮量×6.25
三聚氰胺含氮量为66.6%，是鲜牛奶的151倍， 是奶粉的23倍。

测得某一蛋白质样品的氮含量为0.40g,此 样品约含蛋白质多少 ( )
A.பைடு நூலகம்.00g B.2.50g C.6.40g D.3.00g E.6.25g
3、杂环氨基酸（2种）
组氨酸 （His, H）
脯氨酸 （Pro, P）
说明：关于杂环氨基酸和杂环亚氨基酸
色氨酸 （Trg,W）
组氨酸 （His, H）
脯氨酸 （Pro, P）
芳香族氨基酸
杂环亚氨基酸
杂环氨基酸
（二）按R基的极性性质分类 20种基本氨基酸可分成以下4组： 1、非极性R基氨基酸（8种） Ala、Val、Leu、Ile、Phe、 Met、 Pro、Trp
第二节
一、蛋白质的水解
蛋白质的氨基酸组成
完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得 到多肽片段。
1. 酸水解
方法：常用6 mol/L HCl或4 mol/L H2SO4，回流 煮沸约 20 h。 优点：不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸。 缺点：色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨 基酸（丝氨酸、苏氨酸）有一小部分 被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基 被水解成羧基。
2、不带电荷的极性R基氨基酸（7种） Ser、Thr、Tyr 含羟基； Asn、Gln 含酰胺基 ； Cys 含巯基（-SH）； Gly （因 α-C上的H受易解离的α-氨基和α羧基的影响，体现不出极性，故有的书 中将其列为非极性类）
3、极性带正电荷的R基氨基酸（3种）
3种碱性氨基酸：Lys、Arg、His 在 pH7 时带正电荷 ♦在 pH6.0 时，His 的 R 基 50% 以上质子 化，但 pH7.0 时，质子化的分子不到10%。 His 是唯一的R 基的pKa值在7附近的氨基酸 4、极性带负电荷的R基氨基酸（2种） 2种酸性氨基酸：Asp、Glu
甘氨酸 Gly, G
丙氨酸 Ala, A
缬氨酸 Val, V
亮氨酸 Lue, L
异亮氨 酸 Ile, I
●●
含羟基或硫氨基酸 (一氨基一羧基)（4种）
丝氨酸 (Ser, S)
苏氨酸 (Thr, T)
半胱氨酸 (Cys, C)
甲硫氨酸 (Met, M)
●●●
酸性氨基酸(一氨基二羧基)及其酰胺（4种）