药用植物内生菌的分离及抗菌活性的初步研究_杜慧娟

注: 5 \ 15. 0mm 为强抑菌; 10. 0mm[ 5 < 15. 0mm 为中度抑菌; 5. 0mm < 5 < 10. 0mm 为弱抑菌; 5 [ 5. 0mm 无抑菌效果。
表 2 为改良 K - B 滤纸片法测定植物内生菌 FE - R9、TE - R7、PE - S11对 10种人畜病原菌的 抑制作用, 由表看出, 三种植物内生菌对枯草芽孢杆 菌、肺炎氏链球菌、大肠杆菌、白色念珠球菌都有很
氨基酸和生物资源
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表 2 三株植物内生真菌对人畜病原菌的抑制结果
指 示菌
金黄色 葡萄球菌 蜡样芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 李斯特菌 肺炎氏链球菌 大肠杆菌 伤寒沙门氏菌
宋内氏 志贺氏菌 铜绿假 单孢杆菌
白色念珠球菌
FE- R9 10. 8 ? 0. 4 12. 4 ? 0. 8 15. 3 ? 0. 2 13. 7 ? 0. 6 19. 5 ? 1. 1 23. 2 ? 1. 3 15. 2 ? 0. 7 13. 6 ? 1. 1 14. 9 ? 0. 8 15. 4 ? 0. 3
采用改进滤纸片法测定内生菌发酵液对细菌及
白色念珠菌的抑制作用: 将活化好的指示菌与一定 量的培养基混匀 ( 使菌的终浓度为 105 CFU # L- 1 ) , 倒平板, 待培养基凝固后, 将直径为 5 mm 的无菌滤 纸片贴放在培养基上, 每平板 可放 4片; 取上述样 品, 加入 1 mL 无菌水溶解, 在每个纸片上各打入样 品 15 LL, 37e 培养 24 h, 重复 3次, 十字交叉法测
方式, 设置三组平行实验, 每组设 12个梯度, 测定植
物内生菌发酵液的 M IC 值。
1. 3. 6分类鉴定 参照文献 5伯杰氏细菌鉴定手册 6、5常见细菌
鉴定手册 6、5真菌鉴定手册 6及 5半知菌属图解 6, 对
分离的具有活性的内生菌 进行显微形态特 征的观
察、分类鉴定。
2 结果与分析 2. 1 三种药用植物内生菌的分离情况
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杜慧娟等: 药用植物内生菌的分离及抗菌活性的初步研究
次, 处理完毕。在无菌条件下, 用灭过菌的手术剪将 植物根、茎、叶剪成小段, 从中间剪开后, 分别置于水 琼脂平板和植物水提液平板。观察外植体侧面或顶
端有菌落形成, 挑取内生细菌到牛肉膏蛋白胨固体 培养基中, 挑取内生真菌菌丝到 PDA 培养基中纯化 数次, 将纯化好的菌种接种到斜面培养基上保存备 用。空白对照: 将上述经过表面消毒后未作任何处理 的材料直接置入 2种空白平板中, 27e 培养, 结果材 料周围未见任何菌长出, 证明所分菌株为内生菌。 1. 3. 2 植物内生菌液体培养及发酵液处理
内生真菌: 用直径 为 6 mm 的打孔器打取一个 菌饼, 接种 环挑至 100 mL PDA 液体 培养基 中, 置 150 r# m in- 1摇床 27 e 培养 6~ 7 d; 内生细菌: 用接 种环挑取菌落, 接种于 100 m L 牛肉膏蛋白胨液体培 养基中, 置 150 r# m in- 1摇床 37 e 培养 3~ 4 d。加 入等体积的 95% 乙醇, 静置 24 h后, 3000 r# m in- 1 离心 10 m in。取上清液, 40e 减压蒸馏, 真空抽干 后, 样品保存于 4 e 冰箱, 待做抑菌试验。 1. 3. 3 供试菌的制备
从金荞麦、款冬、黄皮树三种药用植物的根、茎、 叶中共分离到内生菌 38株 (见表 1), 真菌 26株, 细 菌 12株, 分别占分离总数的 68. 4% 和 31. 6% 。其 中金荞麦 14株, 款冬 13株, 黄皮树 11株, 分别占内 生菌分离总数的 36. 4% , 34. 2% , 28. 9% 。从叶子 中分离的菌株最多, 占 42. 1% , 其次是茎、根。由于 不同植物, 其内生菌生长速度对环境的要求各不相 同, 部分肉眼无法识别, 及在培养基中未见明显生长 的菌株, 未计算于内。
株样品、款冬 ( T ussilago farfara L. ) 整株样品、黄皮 树 ( Phellodendron chinense Schne id) 新鲜茎段 ( 直径 约 1. 5 cm )均采自重庆市南山中草药植物研究所, 海拔 500~ 600 m。 1. 2 拮抗指示菌
金黄色葡萄 球菌 ( S taphy lococcus aureus )、铜绿 假单 孢菌 ( P seudom onas aerug inosa ) 、白 色 念 珠 菌 ( Candida alb icans) , 由贵州省中科院天然产物化学 重点实验室药物筛选中心提供。
中图分类号: Q 949. 32
文献标识码: A 文章编号: 1006- 8376( 2008) 01- 0061- 04
近年来, 从天然产物中筛选生物活性成分或先 导化合物成为研究创制新药的有效途径之一。植物 历来是筛选天然药物最主要的原料, 但药用植物的 过度使用, 使得许多药用植物濒临灭绝。为解决资 源问题, 近年来, 药用植物新资源研究的一个热点集 中在药用植物内生菌 上 [ 1] 。内生菌 是指其生活史 中的某一段时期生活在健康植物组织内部, 不引起 植物组织明显侵染及 症状改变的一类 菌 [ 2] 。植物 内生真菌在植物微生态系统中, 长期与宿主建立了 和谐的联合关系, 其次生代谢产物十分丰富 [ 3 ] 。有 关研究表明, 从植物的根、茎、叶、果实等分离到的植 物内生菌, 存在普遍的抗 菌活性 [ 4] , 而近几年从多 种植物内生菌中分离出的活性次生代谢产物陆续报 道 [ 5~ 7] 。有研究显示, 51% 的从植物内生真菌分离 的生物活性物质是以 前没有发现的化 合物 [ 8] 。这 对抗菌活性物质来源的新领域的开发将具有十分重 大的经济意义 [ 9] 。内生菌具有潜在的应用价值, 但 绝大多数植物内生菌还没有被研究, 迄今研究过的 植物不过数百种, 这相对于自然界存在的 25万余种 植物来说是微不足道的 [ 10] 。本文通过对三种药用 植物内生菌的分离, 初步筛选具有广谱抗菌活性的 内生菌, 旨在寻找新的具有抗人畜及植物病害的天 然活性成分, 从而进一步丰富植物内生菌资源。
1. 3 方法 1. 3. 1植物内生菌的分离、纯化及保存
取新鲜健康植物的根、茎、叶, 分别用水冲洗干 净, 用滤纸吸干水分, 采用本实验前期建立的方法进 行表面消毒处理: 无菌 水冲洗 2 遍, 先用体 积分数 75% 酒精浸泡 1 ~ 1. 5 m in ( 叶子 1 m in, 根、茎 1. 5 m in) , 无菌水冲洗 3~ 4遍, 再用 0. 1% 升汞浸泡 1~ 1. 5 m in( 叶 1m in, 根、茎 1. 5 m in), 无菌水冲洗 4~ 5
复 3次。十字交叉法测量菌落直径, 计算发酵液对 菌丝生长的抑制率。
生长抑制率
(%
)
=
对照菌落直径 - 处理 对照菌落直径 - 菌
菌落直径 饼直径
@ 100
1. 3. 5最低抑菌浓度 ( M IC )的测定
将发酵液浓缩抽干后, 配制成一定浓度, 采用琼 脂二倍稀释法 [ 12] 与改进 K - B 纸 片扩散法结合的
氨基酸和生物资源 2008, 30( 1 ) : 61~ 64 Am ino Acid s& B iotic R esources
药用植物内生菌的分离及抗菌活性的初步研究
杜慧娟 1, 王Βιβλιοθήκη Baidu初 1. 2* , 米鹏程 1, 冯 薇 1
( 1. 重庆大学生物工程学院, 重庆 400044; 2. 江苏科技大学生物技术学院, 镇江 212028)
取供试细菌接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上
活化, 白色念珠球菌在沙保氏葡萄糖培养基上活化, 挑取菌落稀释, 使其浓 度达到 108 CFU # L- 1 后用 做抑菌试验; 植物病原 微生物在 PDA 培养 基上活 化, 用直径为 6 mm 的打孔 器打取菌 饼, 用 做抑菌 试验。 1. 3. 4 抑菌试验
摘要: 为研究药用植物金荞麦、款冬及黄皮树中内生菌的抗菌活性, 筛选具有广 谱抗菌效果的内生菌。以导致人 畜及植物
致病的 15种病 原微生物为拮抗菌株, 采用改进 K - B纸片法、生长速率法及琼脂二倍稀释法进行抑菌 试验。结果从 三种药用
植物中共分离到内生菌 38株, 其中 FE- R9、TE- R 7、PE - S11三株内生真菌发酵液提取物对 10种人畜 指示菌的最 低抑菌浓
药用植物名称
金荞麦 款冬 黄皮树
表 1 三种药用植物内生菌的分布
根
细菌菌 株 /株
真菌菌 株 /株
1
4
1
4
-
-
茎
细菌菌 株 /株
真菌菌 株 /株
2
2
3
-
2
3
叶
细菌菌 株 /株
真菌菌 株 /株
1
4
2
3
-
6
内生菌分离总数
14 13 11
2. 2 三株具广谱抗菌活性植物内生菌的抗菌结果 对上述 38株植物内生菌进行抗菌活性检测结
内生真菌抑菌圈直径 /mm TE- R 7
12. 7 ? 1. 4 10. 4 ? 0. 3 18. 3 ? 1. 8 10. 7 ? 0. 4 22. 5 ? 0. 9 25. 3 ? 1. 6 13. 1 ? 0. 8 9. 8 ? 1. 2 23. 5 ? 1. 7 19. 7 ? 0. 5
PE- S11 21. 4 ? 0. 9 16. 1 ? 1. 8 16. 2 ? 1. 4 11. 5 ? 0. 7 24. 2 ? 1. 6 15. 7 ? 0. 5 13. 7 ? 1. 9 13. 8 ? 1. 5 30. 0 ? 0. 7 18. 5 ? 0. 3
1 材料与方法
收稿日期: 2007 - 11- 26 作者简介: 杜慧娟, 女 ( 1982- ) 在读硕士研究生, 主要从事微生物学 研究 基金来源: 江苏省自然科学基金资助项目 ( N o. BK 2005059) * 通迅作者
1. 1 材料来源 金荞麦 ( Fagopyrum dibotry s ( D. Don ) H ara ) 整
枯草 芽 孢 杆菌 ( Bacillu s subtilis ) 、大 肠 杆 菌 ( E scherichia coli )、肺 炎 链 球 菌 ( strep tococcus pneum oniae), 由重庆医科大学提供。
蜡状芽孢杆菌 ( Bacill us cereus)、单增李斯特菌 ( L. m onocy tohenes )、伤 寒 沙 门 氏 菌 ( Salm onella typhi )、宋内 氏志贺氏 菌 ( Shigella sonnei )、黑 曲霉 (A sp ergillus niger)、玉米大斑病菌 (Ex erohilum turcicum )、小 麦赤霉病 菌 ( (F usarium gram inearum )、甘 蓝黑斑病菌 (A lternaria brassicae)、四季豆炭疽病菌 ( Colletotrichum lindem uthianum ) , 由重庆大学生物工 程学院微生物实验室提供、保存。
度 ( M IC)分别在 7. 50~ 15. 00 g# L- 1、3. 13~ 12. 50 g# L- 1、0. 39~ 15. 00 g# L- 1之间。 FE- R 9、TE- R7、PE - S11对 多种病
原微生物具有显著抑 制生长的作用, 这可为寻找天然抗菌物质提供资源。
关键词: 内生菌; 抗菌活性 ; 最低抑菌浓度
果表明, 有 12株内生菌对至少一种病原菌有抗菌活 性, 占分离总数的 31. 6% 。重复 15种指示菌的抑
菌试验, 发现三种植物中, FE - R9(金荞麦根内生真 菌 9# )、TE - R 7( 款冬根内生真菌 7# ) 、PE - S11( 黄 皮树茎内生真菌 11# ) 三株内生真菌抗供试指示菌 范围广泛且效果明显 (见表 2、表 3) 。
量抑菌圈直径。
采用生长速率法 [ 11] 测定内生菌发酵液对植物
病原菌的抑制作用: 100 m L 发酵液减压蒸馏真空抽
干后, 用 10 mL 无菌水溶解, 加入到预先灭菌的 90 mL PDA 培养基中, 摇匀后倒入直径 90 mm 的培养
皿中 ( 灭菌 ), 制成平板。以无菌水为对照。取病原
菌菌饼 (直径 6 mm ) 接种在平板中央, 27e 培养, 重