固相萃取液相色谱串联质谱法测定

DO I :10.3724/S P.J .1096.2010.00214
固相萃取 液相色谱串联质谱法测定城市污水中他莫昔芬和来曲唑
刘先军
1,2
张晶1
邵兵
*1,2
尹杰
1,3
1
(北京市疾病预防控制中心,北京100013) 2
(首都医科大学公共卫生与家庭医学学院,北京100058)
3
(北京大学医学部公共卫生学院,北京100191)
摘 要 他莫昔芬和来曲唑常用于治疗雌激素依赖型乳腺癌。

本研究建立了城市污水中他莫昔芬和来曲唑的超高效液相色谱 串联质谱(UPLC M S /M S)联用检测方法。

水样通过O asis HLB 固相萃取柱富集后串联氨基柱,先用6mL 甲醇洗脱,再用3mL 甲醇洗脱氨基柱,合并洗脱液后浓缩。

使用ACQU I TY U PLC T M BE H C 18反相柱,流动相为0.1%甲酸 乙腈,在梯度条件下分离;目标分析物使用超高效液相色谱 电喷雾串联质谱进行测定。

本方法对他莫昔芬和来曲唑的线性范围分别是1.0~100 g /L 和0.1~100 g /L,相关系数R 2>0 997,检出限分别为1.0和0.1ng /L,进水和出水的3个不同水平的加标平均回收率为68.8%~103 0%,相对标准偏差小于15%。

本方法可用于城市污水中相关物质的分析。

关键词 超高效液相 串联质谱法;他莫昔芬;来曲唑;环境污水;固相萃取
2009 06 22收稿;2009 11 18接受本文系国家自然科学基金(N os .20607004,20837003)资助项目*E m ai:l s h aob i ngch @s i na .co m
1 引 言
现有毒理学实验和野外调查研究表明,一些人工合成的化合物表现出类激素或抗激素作用
[1~5]
,其
中环境雌激素类物质如烷基酚、双酚A 、多氯联苯类等报道较多[6~8]
,而有关环境抗雌激素类物质的研
究却较少[9~13]。

他莫昔芬和来曲唑是典型的抗雌激素药物,主要用于治疗雌激素依赖型乳腺癌。

据估计2005年国内他莫昔芬的年产量约为5万吨,这些药物在使用后最终会随着医疗废水、生活污水等排放进入污水处理系统。

2006年,Roberts 等
[10]
在英国北部泰恩河下游污水处理厂出水中检测出他莫昔
芬,检出率为100%,最高浓度达212ng /L ;同年,Ann ick 等[11]
在瑞士Lausanne 和M o r ges 两个污水处理
厂出水中检测出1~4ng /L 他莫昔芬。

有关环境水体中来曲唑的存在水平的报道很少。

他莫昔芬及其光解产物能抑制网纹蚤等水生物生长分化,具有明显的慢性毒性作用[12]。

因此,研究环境水体中抗雌
激素类药物的存在水平和生态效应具有重要意义。

本研究以抗雌激素类药物他莫昔芬和来曲唑为研究对象,利用固相萃取富集净化,液相色谱 串联质谱技术分析城市生活污水中相关化合物,并应用于实际污水样品分析。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
W aters AC QU I TY TM
超高效液相色谱,M icro m ass Quattro Pre m ier XE 质谱仪(W aters 公司)。

O asis HLB (500m g ,6mL)、Sep Pak C 18(500m g ,6mL)、Sep Pak NH 2(500m g ,3mL)和Sep Pak S ilica(500m g ,6mL)固相萃取(SPE )柱(W aters 公司);GF /A 玻璃纤维滤纸(W hat m an 公司)。

甲醇、乙腈(H PLC 级,D i k m a 公司),甲酸(H PLC 级,Fl u ka 公司),NH 3 H 2O 和H C l(分析纯,北京化学试剂公司)。

他莫昔芬和来曲唑标准品(加拿大To r onto Research Che m icals 公司)。

2.2 标准溶液的配制
准确称取他莫昔芬和来曲唑标准品各0.0100g ,分别置于10mL 棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,混匀,配制成1.0g /L 的标准储备溶液,-18 避光保存。

精密量取他莫昔芬和来曲唑储备液各
第38卷2010年2月
分析化学(FENX I HUAXU E) 研究报告Ch i nese Journa l o f A na l y tica l Che m i stry
第2期214~218
100 L 至10mL 容量瓶中,甲醇定容,配制成10.0m g /L 的混合标准中间溶液,-18 避光保存。

2.3 UPLC M S/M S 分析条件
2.3.1 液相色谱条件 W aters ACQU I T Y UPLC TM
BE H C 18色谱柱(100mm 2.1mm .i d ., 1.7 m );柱温:40 ;样品室温度:4 ;进样体积:10 L 。

流动相A 为0.1%甲酸水溶液,流动相B 为乙腈;流速为0.3m L /m i n 。

梯度洗脱程序为:0~3m in ,95%~40%A;3.0~4.5m i n 40%~0A,保持2.5m in ;7.0~7.1m i n ,0~95%A,保持3.0m in ,等待下一次进样。

2.3.2 质谱条件 电离方式:电喷雾正离子模式;毛细管电压:3.5kV;锥孔电压:40V;离子源温度:100 ;脱溶剂温度:450 ;脱溶剂气流量:600L /h ;碰撞腔真空度:0.3Pa 。

选择多反应监测模式(MR M )采集,质谱条件参数见表1。

表1 来曲唑和他莫昔芬的质谱检测条件T able 1 LC M S /M S acqu i sition para m eters for l e tro zole and tamox ifen
化合物
Co m pound 保留时间Ret en ti on ti m e (m i n)
监测离子对
Ion tran siti on (m /z )
锥孔电压
C one vo l tage (V)
碰撞能量
Colli s i on en ergy (e V )
来曲唑Letrozole 3.47286.1/217.0*
286.1/189.9
183220他莫昔芬T a moxifen 4.33
372.3/72.4*72.3/129.2
35
2325
*定量离子(Quantification i on)
2.4 样品前处理
城市污水,包括进水和出水,取自北京某市政污水处理厂。

水样经GF /A 玻璃微纤维滤纸过滤,4 保存,在24h 内进行处理。

取500m L 水样调至p H 5,以10mL /m i n 的速度通过预先用6mL 甲醇和6mL 超纯水活化的HLB 固相萃取柱。

上样完毕后用4mL V (甲醇) V (H 2O )=2 8溶液淋洗,然后将小柱减压抽干。

将3mL 甲醇预活化过的氨基柱串联在HLB 下面,先用6mL 甲醇洗脱HLB 柱,然后将HLB 柱取下,再用3mL 甲醇洗脱氨基柱,洗脱液在微弱的氮气流下吹干,然后用V (甲醇) V (H 2O)=1 1溶液定容至1.0mL ,用于UPLC M S /MS 测定。

3 结果与讨论
3.1 色谱条件的优化
考察了反相色谱常用的流动相对两种目标化合物色谱行为的影响(图1),结果发现,以甲醇 水和乙腈 水为流动相时,他莫昔芬峰宽且均有拖尾现象,这可能是因为他莫昔芬季胺基易与色谱柱上残余硅醇基相互作用的结果。

由于他莫昔芬具有弱碱性,当流动相中加入甲酸,会促进其电离,并为阳离子的形成提供必需的质子来源,从而提高其离子化效率。

同时,在流动相中加入甲酸有助于色谱柱内硅胶硅醇基的质子化,消除硅醇基与他莫昔芬之间的相互作用,减少峰拖尾,改善其色谱峰形。

考察了甲酸体积浓度分别为0.01%,0.02%,0.05%,0.1%和0.2%时的色谱峰情况。

结果表明,甲酸浓度为0 1%时峰形较好(如图1a 与1b)。

这是由于甲酸浓度过低,目标化合物电离不充分;而甲酸浓度过高时,溶液中的酸度偏高,抑制目标化合物电离,使响应值降低。

与甲醇相比,乙腈作为流动相时,响应值稍高,因此选择乙腈 0.1%甲酸作为流动相。

3.2 质谱条件的优化
为了实现目标化合物的痕量分析,需要采用MRM 模式。

首先,在流动注射状态下,分别将0.5m g /L 单标溶液在正离子和负离子模式下进行全扫描以选择适当的分子离子峰和电离方式。

结果表明:在正离子模式下,[M +H ]+
为最强峰,选择其作为母离子进行下一步的碰撞诱导解离,并对毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂温度、碰撞能量等参数进行了优化。

他莫昔芬和来曲唑的子离子扫描图及碰撞诱导解离图见图2。

选择丰度较高、干扰较小的两对子离子为定性离子,丰度最高的作为定量离子,另一个为定性离子,表1列出了2种化合物的质谱条件。

3.3 固相萃取柱选择
本实验采用固相萃取技术完成水体中目标化合物的富集和净化,根据他莫昔芬和来曲唑的化学结
215第2期刘先军等:固相萃取 液相色谱串联质谱法测定城市污水中他莫昔芬和来曲唑
图1 不同流动相条件下来曲唑和他莫昔芬的总离子流色谱图
F i g .1 T otal ion chro m a t og ram s o f letrozo le and ta m ox ifen when usi ng different mob ile phase
a .0.1%甲酸 乙腈(W ater con tai n i ng 0.1%for m i c aci d aceton i trile);
b 。

0.1%甲酸 甲醇(W at er contai n i ng 0.1%for m i
c aci
d m et hano l );c .水 乙腈(W ater acet on itrile); d.水 甲醇(W ater m et ho m al)。

1.来曲唑(Letroz ole);2.他莫昔芬(Ta m oxifen)。

构和辛醇 水分配系数(l o g K ow 分别为7.1和2.5),选择反相的OasisHLB 和Sep Pak C 18两种固相萃取小柱进行比较。

用加标浓度为20ng /L 的500mL 超纯水溶液(pH 分别为3.0,5.0,7.0和10.0)评价这两种柱子的回收率,结果表明,纯水加标时H LB 和C 18柱回收率相近,随着p H 值的变化,来曲唑略有回收率变化,H LB 柱和C 18柱的回收率分别为92.0%~119%和83.8%~95.5%。

这与来曲唑较低的酸碱电离常数(p K a 1.7)有关,p H >3时来曲唑基本以分子状态存在;但pH 对他莫昔芬影响较明显:在pH 为3.0和5.0时,回收率稳定,HLB 柱和C 18柱的回收率分别为78.0%~79.6%和64.9%~83.6%。

但pH
为7.0和10.0时,回收率显著下降,H LB 柱和C 18柱的回收率分别31.9%~41.0%和36.0%~31.5%。

这是由于他莫昔芬的p K a =8.7,p H 为7.0和10.0时,部分他莫昔芬以分子态存在,同时该物质具有较高的log K ow 值,在反相固相萃取柱上具有较强的保留能力,所以6mL 甲醇不能洗脱完全。

根据以上的结果,上样前调样品的p H =5.0,并进一步利用污水样品加标考察经H LB 柱和C 18柱处理后的基质抑制效果。

在pH =5.0
时用加标污水对这两种小柱进行评
图2 他莫昔芬(a)和来曲唑(b)的质谱裂解图
F ig .2 P roposed frag m entati on sche m e of pro tonated tamox ifen(a)and letrozo l e(b)
价。

实验发现,水样经HLB 小柱富集后,两种物质的基质抑制率约为80%;经C 18小柱富集后来曲唑的抑制率大约在80%,而他莫昔芬完全被抑制。

为了减少基质抑制率,有必要对H LB /C 18富集后的样品进行再净化。

考察了两种常用的正相固相萃取小柱氨基柱和硅胶柱,结果显示,氨基柱的净化效果(基质抑制率约为40%)明显优于硅胶柱(基质抑制率大于60%),且氨基柱的回收率均高于85%。

因此,实验最终选择HLB 和氨基固相萃取柱用于样品的富集净化。

3.4 回收率、精密度、检出限及线性范围
用50%(V /V )甲醇稀释2.2节中配制的混合标准中间液,配制成质量浓度分别为0.1,0.5,1.0,5 0,10.0,50.0和100.0 g /L 的系列混合标准溶液进行测定。

以峰面积Y 对相应浓度x ( g /L)进行线性回归分析,他莫昔芬和来曲唑线性方程分别为Y =4250.6x +227.5和Y =746.9x +25.1;线性范围分别为0.1~100 g /L 和1.0~100 g /L ;回归系数(R 2
)分别为0.998和0.999。

以加标1.0ng /L 实际水样检出信噪比(S /N >3)确定检出限,污水中他莫昔芬和来曲唑的检出限分别为0.3和0.04ng /L ,定量限(S /N >10)分别为1.0和0.1ng /L 。

216
分析化学第38卷
分别取污水处理厂的空白出水和进水加入适量的混合标准溶液,使得他莫昔芬和来曲唑浓度分别为2.0,10.0和50.0ng /L ;按所选条件进行处理和测定,回收率及相对标准偏差(RSD)如表2所示,平
均回收率为68.8%~103.0%,相对标准偏差小于15%,满足环境样品中痕量污染物分析的要求。

与Zhang 等
[17]
采用超纯水加标,通过H LB 富集等处理所得的平均回收率为52%相比,本实验他莫昔芬在
污水中加标浓度为2ng /L 时平均回收率为68.8%,是可以接受的。

表2 他莫昔芬和来曲唑的加标回收率及相对标准偏差(n =6)T able 2 Spi ked recover i es and R SD o f ta m ox ifen and letrozo le i n sew age(n =6)
化合物
Co m pound 水样Sewage sa m ple 加标Sp i ked 2ng /L 回收率Recovery (%)RSD
(%)加标Sp i k ed 10ng/L 回收率
Recovery (%)RSD (%)加标Sp i ked 50ng /L 回收率
Recovery (%)RSD
(%)他莫昔芬Ta m ox ifen 进水In fl uent 77.66.386.92.385.63.3出水E ffl u ent 68.810.372.45.281.39.8来曲唑L etrozol e 进水In fl uent 95.314.4103.05.298.67.4出水E ffl u ent
92.0
3.7
100.6
11.6
98.7
12.0
3.5 实际样品测定
用本方法对北京市某污水处理厂3次采样的进水和出水进行检测。

在进水水样中可检测到0.1~0.4ng /L 来曲唑,在出水水样中可检测到0.1~0.3ng /L 来曲唑(见图3);所有水样中均未检出他莫昔
芬,这与文献[9,10]有差别。

这可能是由于近年来他莫昔芬的使用量有所降低[14]
,而来曲唑作为抗雌激素新药,治疗效果好,副作用相对少,后者在北京地区使用可能较多[15]
;同时,他莫昔芬是光敏药物,
在紫外光持续照射5d 后,约90%他莫昔芬分解[13]。

有关这两种物质在医院废水、自然水体的污染状
况和环境行为正在研究中。

图3 标准样品(1 g /L )和出水样品中来曲唑的LC M S /M S 色谱图
F i g .3 LC M S /M S chroma tog ram s o f letrozo le i n a standard samp l e and a e ffl uent sa m ple
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Tande m M ass Spectro m etry
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*
1,2
,Y I N J i e 1,3
1(Central Laboratory,B eijing Center for D isease Control&P revention ,B ei j i ng 100013)
2
(School of Public H ealth and Fa m il y M edicine ,Cap italM e d ical University,Beijing 100058)
3
(School of Public H ealth ,P eking University,Beijing 100191)
Abst ract Ta m ox ifen and letrozo le are t w o of the m ost effecti v e phar m aceu tica ls m ainly used in hor mona l
dependent breast cancer therapy .A trace analyti c al m ethod usi n g u ltra perfor m ance li q u i d chro m atography /tande m m ass spectro m etry (UPLC M S /M S)w as deve l o ped to si m u ltaneously detect these t w o drugs in both i n fl u ent and effl u ent ofm un icipa l se w age treat m ent p lan.t Se w age sa m ples were passed thr ough an O asisH LB cartri d ge ,then an a m i n o so li d phase ex traction cartri d ge w as connected w ith O asis HLB cartri d ge .Targe t co m pounds w as firstly eluted w ith 6mL m ethano l and then 3mL m ethano lw as used to e l u te the a m i n o so li d phase ex tracti o n cartridge ,co ll e cted and poo l e d the e l u tants .A fter concentration ,
targe t co m pounds w ere
separated on a BE H C 18co lu m n usi n g a grad i e nt e l u ti o n profile w ith a m ob ile phase consisting o f 0.1%for m ic acid aqueous so l u ti o n and acetonitrile and de tected by an e lectro spray ion izati o n tande m m ass spectro m etry w it h m ulti p le reactionsm onitori n g (MRM ).Satisfactor y li n earity(R 2
>0.997)w as obtained over the range o f 1.0-100 g /L and 0.1-100 g /L for ta m ox ifen and letrozo le ,respectively ,w ith li m its of quantifi c ation (LOQ )o f 1.0and 0.1ng /L .M ean recoveries of t w o target co m pounds(spiked in se w age sa m ples at three concentration leve ls)ranged fro m 68.8%to 103.0%,w it h relative standar d dev iations(RSD )less than 15%.This m ethod can be applied for the ana l y sis o f target dr ugs se w age sa m ples .
K eywords U ltra perfor m ance li q u i d chro m atography /tande m m ass spectro m etry ;Ta mox ifen ;Letrozo le ;Se w age ;Solid phase ex traction
(R eceived 22J une 2009;accep t ed 18Nove mb er)
218
分析化学第38卷。