基质效应
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基质效应
杭州和合医学检验实验室有限公司
汇报人：陈均
目录
Contents
01、 基质效应定义 02、 基质效应产生原因
03、 基质效应确认 04、 基质效应消除方法
一、定义： 什么是基质，什么是基质效应
基质：指标本中除分析物以外的一切组成。以测定血中维生素A的 浓度为例，除了维生素A之外的蛋白、磷脂及其他内源性物质皆为 基质。 基质效应（美国临床实验室标准化委员会（NCCLS））： ① 标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响； ② 基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义说来，基 质效应也应包括已知的干扰物（如红霉素测定中磷脂、血红蛋白、 抗坏血酸等都是干扰物），但目前只将基质效应限于生物材料中 未知或未定性的物质或因素（如粘度、pH等）的影响。
取空白基质样本，经前处理后加 入目标分析物至一定的浓度，可 制备出临界值的1/2、临界值的2 倍、线性范围上限的80% 3个浓度 的样本，每个浓度的样本分为5份， 每份样本重复测定3次。将该样本 与相同浓度的以纯溶剂为基质的 样本一同进样分析，然后比较其 各自的响应值。基质样本和溶剂 样本响应值的差与溶剂样本响应 值的比值即为该过程的基质效应， 该方法用于评价绝对基质效应。 通过改变样本前处理方法或色谱 条件，可以减少或消除绝对基质 效应。
3、内标物的选择
在生物分析中，由于样品处理过程复杂，为了保证其操作的准确性，要使用内标来校正操作的 误差。内标的选择，主要从同位素标记物和待测物的同系物里寻找。实际上，同位素标记物是 最为理想的内标物，它与待测物的化学性质极为相似，基质效应、操作中的环境变化等对他们 的影响也一致，这样就可以出去基质效应的影响。但是由于同位素标记物价格昂贵，而且不易 获得，使这种优越性大打折扣，在不得已的条件下，还需要选择同系物来做为内标，这就需要 通过其他几个方面来尽量的降低基质效应，以满足测定灵敏度和专属性的要求。
感谢观看
Thank you for watching
将含有目标分析物的溶液在色谱 柱之后质谱之前以恒定的速度泵 入质谱仪，再将处理过的空白基 质样本注入质谱仪，液相色谱运 行时使质谱仪持续采集数据。经 过一段时间，分析物在进样时会 显示出一段基线响应，若在分析 物应该被洗脱的梯度区域内出现 明显的基质抑制或增强，说明存 在基质效应。
样本处理 后加入法
2、优化色谱条件、选择合适的质谱参数
一、基质效应的产生，是由于内源性物质与待测物一同流出色谱柱，从而产生竞争抑制引起的。 优化色谱条件，改变内源性物质与待测物在色谱柱上的保留时间，使其流出的速度不同，从而 进入质谱的时间不同，这样就可以去除或降低基质效应的影响。比如待测物易离子化，那么调 节样品或溶液中的pH值，会对它的保留、选择性和灵敏度产生很大的影响。如果有切换阀，最 好把样品峰出峰前一分钟之前的都切换掉。 二、众所周知，基质效应在液质检测中有所体现，但在液相-紫外检测中却没有，这跟它们检测 的原理是相关的。在液质分析中，我们经常使用的是电喷雾离子源（ESI）和大气压化学电离 源（APCI）。ESI源由于其电离原理是液相离子化，内源性物质与待测物竞相竞争液滴表面， 从而基质效应比较明显。所以我们在实际应用中，如果遇到使用ESI源基质效应较大，可以考 虑换用APCI源尝试一下，看看响应是否能够满足要求，基质效应是否有所降低。 同时，我们还可以考察一下正离子检测模式和负离子检测模式下基质效应的大小，一般情况下， 负离子的背景噪音要低于正离子的。
二、基质效应的产生原因
三、基质效应确认方法
混合实验
柱后灌注法
选取目标分析物的纯溶液、生物基质样本 以及二者的1∶1混合液，分别处理后进样 分析。如果1∶1混合液样本的响应值与生 物基质样本和纯溶液样本响应值的均值相 比，差异低于一定比例（20%），则证明 基质效应是否存在并不影响目标分析物的 准确定量，该法用于评价相对基质效应。 以25（OH）D3为例，分别对其绝对基质效 应和相对基质效应进行考察，由于25（OH） D3为内源性激素，很难找到不含25（OH） D3的空白基质，可通过向经前处理的血清 样本中添加一定量的内标25（OH）D3[2H3]作为后加标样本，与等量的未经提取 的纯溶液样本获得的色谱峰面积进行比较， 考察方法的绝对基质效应；采用混合实验 的方法，即通过检测血清基质样本、溶液 基质样本、二者质量比1∶1混合物这3种基 质样本中待测物与内标的峰面积比值来计 算相对基质效应（表1、2）
（此方法以样本处理后加入法为基础，加入了混合实验部分思路）
表3
柱后灌注法
四Hale Waihona Puke Baidu基质效应消除
1、选择合适的样品 制备方法
2、优化色谱条件， 选择合适的质谱条件
3、内标物的选择
1、选择合适的样品制备方法
一、总体来讲，基质效应是与生物样品处理不干净密切相关的。我们可以通过稀释处理后的溶 液或者降低进样量，来降低基质效应对测定的影响，但这是治标不治本，背景噪音在降低的同 时，待测物的响应也降低，对改善我们的测定灵敏度没有太大好处。其实，更为关键的是选择 合适样品前处理方法。 二、我们在生物分析中主要用到沉淀蛋白法（PPT）、液液提取法（LLE）和固相萃取法 （SPE）。PPT适应于绝大多数化合物，对蛋白结合率的高低没有要求，操作步骤相对简捷，缺 点就是处理后的样品不是很干净，内源性物质较多，从而产生较强的基质效应；LLE适于极性 相对小、蛋白结合率低的化合物，提取步骤相对繁琐，但处理后的样品尤为洁净；而SPE根据 填料的不同，适于分析的化合物的种类也有所差别，目前市面上有SPE小柱和SPE 96-well板， 该方法特点是样品处理后干净，操作装置简单，绝大数的内源性物质被去除，使待测物浓缩， 提高检测的灵敏度。
基质抑制效应及基质增强效应
（针对液相色谱-质谱联用技术分析生物样品中的化合物所产生的基质效应）
在生物样品（以血浆为例）中，引起基质效应的主要是磷脂、胆固醇等 内源性物质。他们随同待测物从色谱柱上一起被洗脱出来，经离子源气 化，进入质谱进行检测分析。而就在液滴气化、发生库伦爆炸变成小液 滴直至产生气体离子的过程中，这些内源性的物质由于极性较大，会同 待测物离子竞相竞争液滴表面，从而导致待测物的离子化效率降低或增 强，引起响应降低或增高，这就产生所谓的基质抑制或基质增强效应
混合实验法
中心实验室基质实验方法（以D2、D3为例子）
1、因为空白基质难以提取，所以D2-IS、D3-IS（同位素内标）为作为D2、D3的替代物 2、取5个不同年龄段，性别男女都有的血清样本作为基质参考，复溶液作为空白 3、把5个血清样本进行完整前处理（不加内标），得到的样品溶液作为5种基质，然后建立7种 不同比例的（基质/空白）样本溶液，加入同样量的D2-IS、D3-IS，上机检测（比例为0基质、 10%基质、20%基质、40%基质、60%基质、80%基质、90%基质），得到D2-IS及D3-IS的内标峰 面积（表3） 4、基质效应值为：（1-A/B）*100% 当基质效应 5、只有在基质效应控制在20%以内，方法才能被认可
色谱条件优化举例 请看下面两图，色谱条件优化前
色谱条件优化后
从优化后的色谱图中，可以看出在4.2min左右有部分内源性物质的小峰出现，这说明如果化合物在这时候被洗脱下 来，那么内源性物质就会一同下来，同时进入离子源，从而产生基质效应。为了避免这个问题，我们优化了色谱条 件，将洗脱程序变缓，使内源性物质和待测得化合物分开，这样就减小了基质效应。
杭州和合医学检验实验室有限公司
汇报人：陈均
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Contents
01、 基质效应定义 02、 基质效应产生原因
03、 基质效应确认 04、 基质效应消除方法
一、定义： 什么是基质，什么是基质效应
基质：指标本中除分析物以外的一切组成。以测定血中维生素A的 浓度为例，除了维生素A之外的蛋白、磷脂及其他内源性物质皆为 基质。 基质效应（美国临床实验室标准化委员会（NCCLS））： ① 标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响； ② 基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义说来，基 质效应也应包括已知的干扰物（如红霉素测定中磷脂、血红蛋白、 抗坏血酸等都是干扰物），但目前只将基质效应限于生物材料中 未知或未定性的物质或因素（如粘度、pH等）的影响。
取空白基质样本，经前处理后加 入目标分析物至一定的浓度，可 制备出临界值的1/2、临界值的2 倍、线性范围上限的80% 3个浓度 的样本，每个浓度的样本分为5份， 每份样本重复测定3次。将该样本 与相同浓度的以纯溶剂为基质的 样本一同进样分析，然后比较其 各自的响应值。基质样本和溶剂 样本响应值的差与溶剂样本响应 值的比值即为该过程的基质效应， 该方法用于评价绝对基质效应。 通过改变样本前处理方法或色谱 条件，可以减少或消除绝对基质 效应。
3、内标物的选择
在生物分析中，由于样品处理过程复杂，为了保证其操作的准确性，要使用内标来校正操作的 误差。内标的选择，主要从同位素标记物和待测物的同系物里寻找。实际上，同位素标记物是 最为理想的内标物，它与待测物的化学性质极为相似，基质效应、操作中的环境变化等对他们 的影响也一致，这样就可以出去基质效应的影响。但是由于同位素标记物价格昂贵，而且不易 获得，使这种优越性大打折扣，在不得已的条件下，还需要选择同系物来做为内标，这就需要 通过其他几个方面来尽量的降低基质效应，以满足测定灵敏度和专属性的要求。
感谢观看
Thank you for watching
将含有目标分析物的溶液在色谱 柱之后质谱之前以恒定的速度泵 入质谱仪，再将处理过的空白基 质样本注入质谱仪，液相色谱运 行时使质谱仪持续采集数据。经 过一段时间，分析物在进样时会 显示出一段基线响应，若在分析 物应该被洗脱的梯度区域内出现 明显的基质抑制或增强，说明存 在基质效应。
样本处理 后加入法
2、优化色谱条件、选择合适的质谱参数
一、基质效应的产生，是由于内源性物质与待测物一同流出色谱柱，从而产生竞争抑制引起的。 优化色谱条件，改变内源性物质与待测物在色谱柱上的保留时间，使其流出的速度不同，从而 进入质谱的时间不同，这样就可以去除或降低基质效应的影响。比如待测物易离子化，那么调 节样品或溶液中的pH值，会对它的保留、选择性和灵敏度产生很大的影响。如果有切换阀，最 好把样品峰出峰前一分钟之前的都切换掉。 二、众所周知，基质效应在液质检测中有所体现，但在液相-紫外检测中却没有，这跟它们检测 的原理是相关的。在液质分析中，我们经常使用的是电喷雾离子源（ESI）和大气压化学电离 源（APCI）。ESI源由于其电离原理是液相离子化，内源性物质与待测物竞相竞争液滴表面， 从而基质效应比较明显。所以我们在实际应用中，如果遇到使用ESI源基质效应较大，可以考 虑换用APCI源尝试一下，看看响应是否能够满足要求，基质效应是否有所降低。 同时，我们还可以考察一下正离子检测模式和负离子检测模式下基质效应的大小，一般情况下， 负离子的背景噪音要低于正离子的。
二、基质效应的产生原因
三、基质效应确认方法
混合实验
柱后灌注法
选取目标分析物的纯溶液、生物基质样本 以及二者的1∶1混合液，分别处理后进样 分析。如果1∶1混合液样本的响应值与生 物基质样本和纯溶液样本响应值的均值相 比，差异低于一定比例（20%），则证明 基质效应是否存在并不影响目标分析物的 准确定量，该法用于评价相对基质效应。 以25（OH）D3为例，分别对其绝对基质效 应和相对基质效应进行考察，由于25（OH） D3为内源性激素，很难找到不含25（OH） D3的空白基质，可通过向经前处理的血清 样本中添加一定量的内标25（OH）D3[2H3]作为后加标样本，与等量的未经提取 的纯溶液样本获得的色谱峰面积进行比较， 考察方法的绝对基质效应；采用混合实验 的方法，即通过检测血清基质样本、溶液 基质样本、二者质量比1∶1混合物这3种基 质样本中待测物与内标的峰面积比值来计 算相对基质效应（表1、2）
（此方法以样本处理后加入法为基础，加入了混合实验部分思路）
表3
柱后灌注法
四Hale Waihona Puke Baidu基质效应消除
1、选择合适的样品 制备方法
2、优化色谱条件， 选择合适的质谱条件
3、内标物的选择
1、选择合适的样品制备方法
一、总体来讲，基质效应是与生物样品处理不干净密切相关的。我们可以通过稀释处理后的溶 液或者降低进样量，来降低基质效应对测定的影响，但这是治标不治本，背景噪音在降低的同 时，待测物的响应也降低，对改善我们的测定灵敏度没有太大好处。其实，更为关键的是选择 合适样品前处理方法。 二、我们在生物分析中主要用到沉淀蛋白法（PPT）、液液提取法（LLE）和固相萃取法 （SPE）。PPT适应于绝大多数化合物，对蛋白结合率的高低没有要求，操作步骤相对简捷，缺 点就是处理后的样品不是很干净，内源性物质较多，从而产生较强的基质效应；LLE适于极性 相对小、蛋白结合率低的化合物，提取步骤相对繁琐，但处理后的样品尤为洁净；而SPE根据 填料的不同，适于分析的化合物的种类也有所差别，目前市面上有SPE小柱和SPE 96-well板， 该方法特点是样品处理后干净，操作装置简单，绝大数的内源性物质被去除，使待测物浓缩， 提高检测的灵敏度。
基质抑制效应及基质增强效应
（针对液相色谱-质谱联用技术分析生物样品中的化合物所产生的基质效应）
在生物样品（以血浆为例）中，引起基质效应的主要是磷脂、胆固醇等 内源性物质。他们随同待测物从色谱柱上一起被洗脱出来，经离子源气 化，进入质谱进行检测分析。而就在液滴气化、发生库伦爆炸变成小液 滴直至产生气体离子的过程中，这些内源性的物质由于极性较大，会同 待测物离子竞相竞争液滴表面，从而导致待测物的离子化效率降低或增 强，引起响应降低或增高，这就产生所谓的基质抑制或基质增强效应
混合实验法
中心实验室基质实验方法（以D2、D3为例子）
1、因为空白基质难以提取，所以D2-IS、D3-IS（同位素内标）为作为D2、D3的替代物 2、取5个不同年龄段，性别男女都有的血清样本作为基质参考，复溶液作为空白 3、把5个血清样本进行完整前处理（不加内标），得到的样品溶液作为5种基质，然后建立7种 不同比例的（基质/空白）样本溶液，加入同样量的D2-IS、D3-IS，上机检测（比例为0基质、 10%基质、20%基质、40%基质、60%基质、80%基质、90%基质），得到D2-IS及D3-IS的内标峰 面积（表3） 4、基质效应值为：（1-A/B）*100% 当基质效应 5、只有在基质效应控制在20%以内，方法才能被认可
色谱条件优化举例 请看下面两图，色谱条件优化前
色谱条件优化后
从优化后的色谱图中，可以看出在4.2min左右有部分内源性物质的小峰出现，这说明如果化合物在这时候被洗脱下 来，那么内源性物质就会一同下来，同时进入离子源，从而产生基质效应。为了避免这个问题，我们优化了色谱条 件，将洗脱程序变缓，使内源性物质和待测得化合物分开，这样就减小了基质效应。