胰岛素的制备PPT讲稿
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使其正确连接成了人们关注的问题。
人胰岛β细胞生成胰岛素过程
主要分为三个阶段：
• 第一步，机体首先合成由109个氨基酸组成的前胰岛素原。 • 第二步，前胰岛素原脱去23个氨基酸，转变成含有86个氨
基酸的胰岛素原。胰岛素原分子量为9000，是长的单链， 含胰岛素的A链和B链及连接链。
• 第三步，胰岛素原再脱去4个碱基氨基酸，生成含31个氨
胰岛素的制备课件
必要性
• 胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子居
有高度生物活性，分子量很大，立体结 构异常复杂，体外难以人工合成。所以 过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中 提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素 结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛 素B链第30个基酸残基不同，长期服用会 引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工 程方法获得重组人胰岛素进行治疗。
材料与方法
• 1． 材料 • 1．1 菌种和质粒
E.coli 、JMl09、SMDll68，质粒pUCl8、
pHIL—S1
• 1．2 限制性内切酶
EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ及T4DNA连续酶均
购于Promega公司
• 1．3 培养基·
LB、YPD、RDB、BMG、BMM其中包括的主 要成分YNB(yeastnitrogenbase)购于Difco公 司
• 毕赤酵母是一种甲醇营养酵母， • 用酵母合成胰岛素的主要优点是可以进行体内加工形成二
硫键的正确配对，产物分泌到培养基中，下游纯化比较简 单。
• 甲醇诱导醇氧化酶(Alcohol Oxidase)，AOX的表达是在转
录水平上调控的，其启动子(PAoxl)属诱导型启动子，能非 常有效的控制外源基因的表达。不仅能克服强启动子在宿 主细胞内大剂量表达外源蛋白，会导致宿主细胞受损，甚 至死亡的缺点，而且能高水平表达。
材料与方法
• 1．1 材料 • 1．1．1 质粒与菌株
质粒pJGl03: 含B-C-A人胰岛素原基因 (Met-HPⅠ）；
质粒pJG111：含B—C´—C—A人胰岛素原基 因(Met—双C肽—HPⅠ)表达载体；
质粒pBV220：温度诱导质粒。
• 1．1．2 酶和主要试剂
胰蛋白酶(10900U／mg)、人胰岛素 (26．0U／mg)、猪胰岛素(26．0U／mg)、 羧肽酶B、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、 dNTPs、T4 DNA聚合酶、DNA测序试剂盒、 T7SequencingTMKit、阴离子交换层析柱 ResourceTMQ、SephadexG—75、胰岛素放 免试剂盒、人胎盘胰岛素受体。
一些解决办法
• 替换表达系统,换为酵母或动物细胞等真核
表达系统。
• 仍用E.coli作为表达系统，将胰岛素基因与
一些较大的蛋白分子的基因适当连接，使 表达的蛋白分子量足够大，避免被蛋白水 解酶分解，提高其稳定性及表达率。
• 在A链、B链间加入C链或其功能类似物，使
胰岛素能够形成正确的空间构象。
一、 人胰岛素原在Pichia pastoris （毕赤酵母）中的表达
原理
• 基因工程技术主要内容或步骤可分为目的
基因制备和分离，构建DNA重组体；DNA重 组体扩增和表达，重组体筛选和鉴定；外 源基因表达，产物分离纯化和鉴定以及将 目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细 胞，使之在新的遗传背景下次进行功能性 表达，生产出人类所需要的物质。
预想
• 把人的胰岛素的基因提取出来，接在一
过去人们一直认为C肽含有 使胰岛素二硫键 正确配对足够的结构信息。我国科学家在 成功地解决胰岛素 的A、B 链重组问题及随 后对交联胰岛素的研究后，人们对“C肽含 有使 胰岛素二硫键正确配对的足够的结构 信息”这一论点产生了质疑。
• 20世纪80年代至90年代，科学家对不
同长度的C肽进行了研究，结果表明，C 肽 在胰岛素A、B链正确配对时，可能只起柔 性连结肽作用，使得双分子反应变为分子 内反应 。而A、B链包含了足够的使二硫键 正确配对的信息，C肽的长短可能对A、B链 的重组产生影响。
个小的载体上，得到一个重组的载体， 再转化到真核细胞，细胞并不认为是人 的基因就不管它，会当成自己的基因进 行胰岛素的合成，每一个细胞就相当于 生产胰岛素的工厂，实际上我们可以通 过改变胰岛素基因前面的调控序列，让 细胞停止合成其他的蛋白质，只合成胰 岛素。
• 但是胰岛素的A链、B链分别表达后如何
基酸的C肽及含51个氨基酸的胰岛素分子。
wenku.baidu.com用E.coli做表达系统
及A链、B链分别表达的问题
• E.coli是原核生物没有真核生物翻译后加工、
修饰。
• E.coli中表达的小分子外源蛋白不稳定。 • E.coli与人的种属差异较大，有密码子的偏
好性。
• A链、B链间二硫键正确连接和其空间构象
正确形成较难。
二 . 人胰岛素原及其类似物
在E.coli表达系统中的表达
• 为了使表达的胰岛素原稳定采取了下列方
法： １．构建双Ｃ肽的人胰岛素基因 ２．构建融合蛋白基因（其他蛋白基因＋胰
岛素 原基因）
３．构建胰岛素原基因串
（一）Met－Lys－双Ｃ肽人胰岛素原基因 的构建表达及分离纯化
• 在研究胰岛素的结构与生物功能的关系中，
• 2．2 表达质粒转化酵母SMDl168菌
制备酵母感受态细胞，再将带有外源基因的穿梭
质粒线性化，(可用BglⅡ酶切)。可用电激法，也可用
invitrogen公司提供的转化试剂盒进行转化。
然后在RDB选择培养基上筛选。——般酵母转化 菌需在28—30℃长2—4天。
• 2．3．1 酵母生长期
将转化菌在BMG培养基中生长至OD600=4—6时， 4℃离心3000g，5min，弃上清。
• 2．3．2 诱导表达期
弃上清，菌体重新培养于l／5原体积的BMM培 养基中进行诱导。每隔24小时，加0.5％体积的诱导 剂—甲醇，诱导时间在100h以上。
• 2．3．3 SDS-PAGE凝胶电泳分析
4℃离心7000g，5min，留上清，电泳分析。
• 2．3．4 超滤浓缩与分子筛分离纯化胰岛素原。
• 1．4 其它材料
DNA回收试剂盒购于原平公司
• 2 方法
• 2．1 克隆步骤
扩增已克隆在质粒pUCl8上的胰岛素原基因，用
EcoRI和BamHI双酶切，电泳，琼脂糖凝胶上回收283bp 的胰岛素原基因片段，将穿梭质粒同样用EcoRI和BamHI
双酶切，65℃，15min，酶灭活。酚抽提，酒精沉淀。溶 于0．1XTE中。用T4DNA连接酶连接穿梭质粒与胶上回收 片段。氯化钙法转化到大肠杆菌JMl09中，挑单菌落扩增 鉴定。
人胰岛β细胞生成胰岛素过程
主要分为三个阶段：
• 第一步，机体首先合成由109个氨基酸组成的前胰岛素原。 • 第二步，前胰岛素原脱去23个氨基酸，转变成含有86个氨
基酸的胰岛素原。胰岛素原分子量为9000，是长的单链， 含胰岛素的A链和B链及连接链。
• 第三步，胰岛素原再脱去4个碱基氨基酸，生成含31个氨
胰岛素的制备课件
必要性
• 胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子居
有高度生物活性，分子量很大，立体结 构异常复杂，体外难以人工合成。所以 过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中 提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素 结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛 素B链第30个基酸残基不同，长期服用会 引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工 程方法获得重组人胰岛素进行治疗。
材料与方法
• 1． 材料 • 1．1 菌种和质粒
E.coli 、JMl09、SMDll68，质粒pUCl8、
pHIL—S1
• 1．2 限制性内切酶
EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ及T4DNA连续酶均
购于Promega公司
• 1．3 培养基·
LB、YPD、RDB、BMG、BMM其中包括的主 要成分YNB(yeastnitrogenbase)购于Difco公 司
• 毕赤酵母是一种甲醇营养酵母， • 用酵母合成胰岛素的主要优点是可以进行体内加工形成二
硫键的正确配对，产物分泌到培养基中，下游纯化比较简 单。
• 甲醇诱导醇氧化酶(Alcohol Oxidase)，AOX的表达是在转
录水平上调控的，其启动子(PAoxl)属诱导型启动子，能非 常有效的控制外源基因的表达。不仅能克服强启动子在宿 主细胞内大剂量表达外源蛋白，会导致宿主细胞受损，甚 至死亡的缺点，而且能高水平表达。
材料与方法
• 1．1 材料 • 1．1．1 质粒与菌株
质粒pJGl03: 含B-C-A人胰岛素原基因 (Met-HPⅠ）；
质粒pJG111：含B—C´—C—A人胰岛素原基 因(Met—双C肽—HPⅠ)表达载体；
质粒pBV220：温度诱导质粒。
• 1．1．2 酶和主要试剂
胰蛋白酶(10900U／mg)、人胰岛素 (26．0U／mg)、猪胰岛素(26．0U／mg)、 羧肽酶B、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、 dNTPs、T4 DNA聚合酶、DNA测序试剂盒、 T7SequencingTMKit、阴离子交换层析柱 ResourceTMQ、SephadexG—75、胰岛素放 免试剂盒、人胎盘胰岛素受体。
一些解决办法
• 替换表达系统,换为酵母或动物细胞等真核
表达系统。
• 仍用E.coli作为表达系统，将胰岛素基因与
一些较大的蛋白分子的基因适当连接，使 表达的蛋白分子量足够大，避免被蛋白水 解酶分解，提高其稳定性及表达率。
• 在A链、B链间加入C链或其功能类似物，使
胰岛素能够形成正确的空间构象。
一、 人胰岛素原在Pichia pastoris （毕赤酵母）中的表达
原理
• 基因工程技术主要内容或步骤可分为目的
基因制备和分离，构建DNA重组体；DNA重 组体扩增和表达，重组体筛选和鉴定；外 源基因表达，产物分离纯化和鉴定以及将 目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细 胞，使之在新的遗传背景下次进行功能性 表达，生产出人类所需要的物质。
预想
• 把人的胰岛素的基因提取出来，接在一
过去人们一直认为C肽含有 使胰岛素二硫键 正确配对足够的结构信息。我国科学家在 成功地解决胰岛素 的A、B 链重组问题及随 后对交联胰岛素的研究后，人们对“C肽含 有使 胰岛素二硫键正确配对的足够的结构 信息”这一论点产生了质疑。
• 20世纪80年代至90年代，科学家对不
同长度的C肽进行了研究，结果表明，C 肽 在胰岛素A、B链正确配对时，可能只起柔 性连结肽作用，使得双分子反应变为分子 内反应 。而A、B链包含了足够的使二硫键 正确配对的信息，C肽的长短可能对A、B链 的重组产生影响。
个小的载体上，得到一个重组的载体， 再转化到真核细胞，细胞并不认为是人 的基因就不管它，会当成自己的基因进 行胰岛素的合成，每一个细胞就相当于 生产胰岛素的工厂，实际上我们可以通 过改变胰岛素基因前面的调控序列，让 细胞停止合成其他的蛋白质，只合成胰 岛素。
• 但是胰岛素的A链、B链分别表达后如何
基酸的C肽及含51个氨基酸的胰岛素分子。
wenku.baidu.com用E.coli做表达系统
及A链、B链分别表达的问题
• E.coli是原核生物没有真核生物翻译后加工、
修饰。
• E.coli中表达的小分子外源蛋白不稳定。 • E.coli与人的种属差异较大，有密码子的偏
好性。
• A链、B链间二硫键正确连接和其空间构象
正确形成较难。
二 . 人胰岛素原及其类似物
在E.coli表达系统中的表达
• 为了使表达的胰岛素原稳定采取了下列方
法： １．构建双Ｃ肽的人胰岛素基因 ２．构建融合蛋白基因（其他蛋白基因＋胰
岛素 原基因）
３．构建胰岛素原基因串
（一）Met－Lys－双Ｃ肽人胰岛素原基因 的构建表达及分离纯化
• 在研究胰岛素的结构与生物功能的关系中，
• 2．2 表达质粒转化酵母SMDl168菌
制备酵母感受态细胞，再将带有外源基因的穿梭
质粒线性化，(可用BglⅡ酶切)。可用电激法，也可用
invitrogen公司提供的转化试剂盒进行转化。
然后在RDB选择培养基上筛选。——般酵母转化 菌需在28—30℃长2—4天。
• 2．3．1 酵母生长期
将转化菌在BMG培养基中生长至OD600=4—6时， 4℃离心3000g，5min，弃上清。
• 2．3．2 诱导表达期
弃上清，菌体重新培养于l／5原体积的BMM培 养基中进行诱导。每隔24小时，加0.5％体积的诱导 剂—甲醇，诱导时间在100h以上。
• 2．3．3 SDS-PAGE凝胶电泳分析
4℃离心7000g，5min，留上清，电泳分析。
• 2．3．4 超滤浓缩与分子筛分离纯化胰岛素原。
• 1．4 其它材料
DNA回收试剂盒购于原平公司
• 2 方法
• 2．1 克隆步骤
扩增已克隆在质粒pUCl8上的胰岛素原基因，用
EcoRI和BamHI双酶切，电泳，琼脂糖凝胶上回收283bp 的胰岛素原基因片段，将穿梭质粒同样用EcoRI和BamHI
双酶切，65℃，15min，酶灭活。酚抽提，酒精沉淀。溶 于0．1XTE中。用T4DNA连接酶连接穿梭质粒与胶上回收 片段。氯化钙法转化到大肠杆菌JMl09中，挑单菌落扩增 鉴定。