血清药物化学和血清药理学相结合的_省略_子细辛汤抗炎和免疫抑制的物质基础_唐锋
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Study on material basis of Mahuang Fuzi Xixin decoction for anti-inflammd on combined method of
serum pharmacochemistry and serum pharmacology
·1971·
2015 年 5 月 第 40 卷第 10 期
Vol. 40，No． 10 May，2015
from Xixin） and five unknown components. Compared with blank serum，drug-containing serum could reduce the release of histamine from ＲBL-2H3 induced by antigen at different time points（ P ＜ 0. 05） ； except the 4-hour drug-containing serum，all of the remaining drug-containing serums could inhibit the ＲBL-2H3 mastocyte degranulation induced by antigen at different time points（ P ＜ 0. 05） . Drug-containing serum could significantly lipopolysaccharide-induced mouse splenocyte proliferation at 15 and 30 min（ P ＜ 0. 05） . A regression analysis was made on the chemical data of components absorbed into blood and pharmacological indexes，i. e. release rate of histamine，release rate of β-hexosaminidase and inhibition rate of splenocyte. This suggested the close correlations among methyl pseudo-ephedrine，pseudoephedrine and histamine released from ＲBL-2H3 induced by antigen； pseudoephedrine，hypaconine，methyl pseudoephedrine and β-hexosaminidase released from ＲBL-2H3 induced by antigen； as well as benzoyl hypaconine，benzoylaconine， 14-benzoyl-10-OH-mesaconine，mesaconine and lipopolysaccharide-induced mouse splenocyte proliferation. Methylpseudoephedrine， pseudoephedrine，benzoyl hypaconine，benzoylaconine and mesaconine may be part of material basis of MFXD on anti-inflammation and immune suppression. ［Key words］ Mahuang Fuzi Xixin decoction； serum pharmacochemistry； serum pharmacology； anti-inflammation； immune suppression
doi： 10． 4268 / cjcmm20151024
过敏性鼻炎是一种常见的鼻黏膜紊乱的过敏性 疾病，目前国内外的治疗过敏性鼻炎西药一般只能 控制症状，且不良反应多。而中药在该疾病的治疗 方面具有安全可靠、副作用小、疗效持久的优势。麻 黄附子细辛汤为张仲景《伤寒论》中的经典名方，由 麻黄、附子、细辛 3 味药组成。经临床及实验研究证 明，麻黄附子细辛汤及其药材活性部位在治疗过敏 性鼻炎方面，疗效显著［1-4］。麻黄附子细辛汤可以通 过抑制肥大细胞和巨噬细胞释放炎症介质而起抗炎 作用［5］。另外，麻黄附子细辛汤可以显著提高降低 抗体活性及激活免疫保护作用［6］。因此，抗炎和免 疫抑制为麻黄附子细辛汤抗过敏性鼻炎的主要药理 作用。本研究拟运用血清药物化学和血清药理学相 结合的方法，探索麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制 的物质基础，为将其开发成预防和治疗过敏性鼻炎 的新制剂提供部分实验依据。 1 材料 1. 1 药物与试剂 麻黄（ 广州致信中药饮片有限 公司，产地吉林，批号 101001） ，制附子（ 清远市新康 中药饮片有限公司，产地山东，批号 20100802） ，细 辛（ 广州致信中药饮片有限公司，产地辽宁，批号 101001） 经本校中药鉴定教研室马骥教授鉴定均为 正品，其中麻黄鉴定为麻黄科草麻黄 Ephedra sinica Stapf 的干燥草质茎，制附子鉴定为毛茛科植物乌头 Aconitum carmichaeli Debx. 的子根的加工 品 （ 白 附 片） ，细辛鉴定为为马兜铃科植物北细辛 Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum（ Maxim. ） Kitag. 的干燥全草。按 2010 年版药典规定项进行检 ·1972·
TANG Feng，LIANG Shao-yu，CHEN Fei-long，TANG Qing-fa，TAN Xiao-mei* （ School of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangdong Provincial
［收稿日期］ 2014-11-25 ［基金项目］ 广东省科学技术厅-广东省中医药科学院联合科研专项（ 2012A032400002） ［通信作者］ * 谭晓梅，研究员，博士生导师，主要从事中药新制剂、新剂型的研究，Tel： （ 020） 61648265，E-mail： txm@ fimmu． com ［作者简介］ 唐锋，硕士研究生，E-mail： tangfeng0322@ 163. com
测，均达到要求。辛芩颗粒（ 四川志远广和制药有限 公司，批号 110409） ，醋酸泼尼松片（ 广东华南药业集 团有限公司，批号 110604） ，盐酸西替利嗪片（ 成都恒 瑞制药有限公司，批号 110206） ，氨基已糖为 Sigma 公 司 产 品 （ 129K5008 ） ，Monclonal Anti-DNP，antibody produced in mouse 为 Sigma 公司产品（ D8406） ，DNP （ 7） -BSA 为 Bioseach technologies Inc 产 品 （ 02184102） ，大鼠组胺酶联免疫分析试剂盒（ Bio-Swamp，批号 ＲA20473） ，其他试剂为国产分析纯。 1. 2 动物 Wistar 大鼠，雌雄各半，体重（ 200 ± 20） g， 昆明种小鼠，雌雄各半，体重 18 ～ 22 g，SPF 级，均由南 方医科大学实验动物中心提供，动物合格证号 SCXK （ 粤） 2006-0015。动物适应性饲养 3 d 后，供试。 1. 3 细胞株 大鼠嗜碱性细胞白血病细胞株 ＲBL2 H3 ，购自中国 科 学 院 上 海 生 命 科 学 研 究 院 细 胞 资 源中心。 1. 4 仪器 Agilent G6410A QQQ LC-MS 液质联用 仪（ 美国 Agilent 公司） ，配有 Agilent 1200 液相色谱 系统，ESI（ 电喷雾电离源） 离子源，MassHunter 数据 工作站。CO2 培养箱 （ Thermo scientific） ； 倒置显微 镜（ optec 奥特光学 BDS200） ； 多功能酶标仪 （ ELX 8000） ； 纯水器（ Molecular） ； 800B 离心机（ 上海安亭 科 学 仪 器 厂 ） ； 低 温 冰 箱 （ 容 声 BCD-239TSC ） ； TD5A-WS 台式低速离心机（ 长沙湘仪离心机仪器有 限公司） ； 所用细胞培养瓶、培养板均为美国 Corning 公司产品。 2 方法 2. 1 麻黄附子细辛汤的制备 按麻黄-制附子-细
Key Lab of Traditional Chinese Medicine Preparations，Guangzhou 510515，China）
［Abstract］ To investigate the material basis of Mahuang Fuzi Xixin decoction（ MFXD） for anti-inflammation and immune-suppression based on the combined method of serum chemical and serum pharmacological. The LC-MS / MS fingerprints of MFXD，drug-containing serum and blank serum were compared to define the components in plasma. Histamine，β-hexosaminidase released from ＲBL-2H3 cell infulenced by drug-containing serum at different time points were measured by ELISA． The effect of drug-containing serum on lipopolysaccharide-induced splenocyte proliferation at different time points were determined by MTT. A correlation analysis was made on components of MFXD and pharmacological indexes based the stepwise regression method. After the intragastrical administration with MFXD，32 components were discovered in rat serum，including 27 prototype components （ 10 from Mahuang，13 from Fuzi and four
2015 年 5 月 第 40 卷第 10 期
Vol. 40，No． 10 May，2015
血清药物化学和血清药理学相结合的方法 探讨麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制的物质基础
唐锋，梁少瑜，陈飞龙，汤庆发，谭晓梅*
（ 南方医科大学 中医药学院 广东省中药制剂重点实验室，广东 广州 510515）
［摘要］ 利用中药血清药物化学及血清药理学相结合的方法探讨麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制的物质基础。通过比较麻 黄附子细辛汤、给药后含药血清和空白血清的 LC-MS / MS 图谱，寻找麻黄附子细辛汤的入血成分； ELISA 法测定各时间点含 药血清对抗原刺激 ＲBL-2H3 细胞释放组胺、氨基己糖苷酶的影响； MTT 法测定各时间点含药血清对脂多糖诱导小鼠脾细胞增 殖的影响； 采用逐步回归的方法对麻黄附子细辛汤的各成分与药理指标进行相关性分析。结果显示，灌胃给予麻黄附子细辛 汤后，从大鼠血清中发现 32 个成分，其中 27 个原型成分（ 10 个来自麻黄，13 个来自附子，4 个来自细辛） ，其他 5 个未知成分。 与空白血清相比，麻黄附子细辛汤各时间点含药血清均能降低抗原诱导 ＲBL-2H3 细胞释放组胺（ P ＜ 0. 05） ； 除麻黄附子细辛 汤 4 h 含药血清外，其余各时间点含药血清均能抑制抗原诱导的 ＲBL-2H3 细胞脱颗粒（ P ＜ 0. 05） ； 麻黄附子细辛汤 15，30 min 含药血清能显著抑制脂多糖诱导的小鼠脾细胞增殖（ P ＜ 0. 05） 。血中移行成分的化学数据和药理指标组胺释放量、β-氨基己 糖苷酶释放率以及脾细胞增殖抑制率进行回归分析，推测甲基伪麻黄碱、伪麻黄碱与抗原诱导 ＲBL-2H3 肥大细胞释放组胺密 切相关； 伪麻黄碱、次乌头原碱、甲基伪麻黄碱与抗原诱导 ＲBL-2H3 细胞释放 β-氨基己糖苷酶密切相关； 苯甲酰次乌头原碱、 苯甲酰乌头原碱、14-苯甲酰-10-羟基-中乌头原碱、新乌头原碱与脂多糖诱导小鼠脾细胞增殖抑制密切相关。由此可见，甲基 伪麻黄碱、伪麻黄碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、新乌头原碱等成分可能为麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制的部分 物质基础。 ［关键词］ 麻黄附子细辛汤； 血清药物化学； 血清药理学； 抗炎； 免疫抑制
serum pharmacochemistry and serum pharmacology
·1971·
2015 年 5 月 第 40 卷第 10 期
Vol. 40，No． 10 May，2015
from Xixin） and five unknown components. Compared with blank serum，drug-containing serum could reduce the release of histamine from ＲBL-2H3 induced by antigen at different time points（ P ＜ 0. 05） ； except the 4-hour drug-containing serum，all of the remaining drug-containing serums could inhibit the ＲBL-2H3 mastocyte degranulation induced by antigen at different time points（ P ＜ 0. 05） . Drug-containing serum could significantly lipopolysaccharide-induced mouse splenocyte proliferation at 15 and 30 min（ P ＜ 0. 05） . A regression analysis was made on the chemical data of components absorbed into blood and pharmacological indexes，i. e. release rate of histamine，release rate of β-hexosaminidase and inhibition rate of splenocyte. This suggested the close correlations among methyl pseudo-ephedrine，pseudoephedrine and histamine released from ＲBL-2H3 induced by antigen； pseudoephedrine，hypaconine，methyl pseudoephedrine and β-hexosaminidase released from ＲBL-2H3 induced by antigen； as well as benzoyl hypaconine，benzoylaconine， 14-benzoyl-10-OH-mesaconine，mesaconine and lipopolysaccharide-induced mouse splenocyte proliferation. Methylpseudoephedrine， pseudoephedrine，benzoyl hypaconine，benzoylaconine and mesaconine may be part of material basis of MFXD on anti-inflammation and immune suppression. ［Key words］ Mahuang Fuzi Xixin decoction； serum pharmacochemistry； serum pharmacology； anti-inflammation； immune suppression
doi： 10． 4268 / cjcmm20151024
过敏性鼻炎是一种常见的鼻黏膜紊乱的过敏性 疾病，目前国内外的治疗过敏性鼻炎西药一般只能 控制症状，且不良反应多。而中药在该疾病的治疗 方面具有安全可靠、副作用小、疗效持久的优势。麻 黄附子细辛汤为张仲景《伤寒论》中的经典名方，由 麻黄、附子、细辛 3 味药组成。经临床及实验研究证 明，麻黄附子细辛汤及其药材活性部位在治疗过敏 性鼻炎方面，疗效显著［1-4］。麻黄附子细辛汤可以通 过抑制肥大细胞和巨噬细胞释放炎症介质而起抗炎 作用［5］。另外，麻黄附子细辛汤可以显著提高降低 抗体活性及激活免疫保护作用［6］。因此，抗炎和免 疫抑制为麻黄附子细辛汤抗过敏性鼻炎的主要药理 作用。本研究拟运用血清药物化学和血清药理学相 结合的方法，探索麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制 的物质基础，为将其开发成预防和治疗过敏性鼻炎 的新制剂提供部分实验依据。 1 材料 1. 1 药物与试剂 麻黄（ 广州致信中药饮片有限 公司，产地吉林，批号 101001） ，制附子（ 清远市新康 中药饮片有限公司，产地山东，批号 20100802） ，细 辛（ 广州致信中药饮片有限公司，产地辽宁，批号 101001） 经本校中药鉴定教研室马骥教授鉴定均为 正品，其中麻黄鉴定为麻黄科草麻黄 Ephedra sinica Stapf 的干燥草质茎，制附子鉴定为毛茛科植物乌头 Aconitum carmichaeli Debx. 的子根的加工 品 （ 白 附 片） ，细辛鉴定为为马兜铃科植物北细辛 Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum（ Maxim. ） Kitag. 的干燥全草。按 2010 年版药典规定项进行检 ·1972·
TANG Feng，LIANG Shao-yu，CHEN Fei-long，TANG Qing-fa，TAN Xiao-mei* （ School of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangdong Provincial
［收稿日期］ 2014-11-25 ［基金项目］ 广东省科学技术厅-广东省中医药科学院联合科研专项（ 2012A032400002） ［通信作者］ * 谭晓梅，研究员，博士生导师，主要从事中药新制剂、新剂型的研究，Tel： （ 020） 61648265，E-mail： txm@ fimmu． com ［作者简介］ 唐锋，硕士研究生，E-mail： tangfeng0322@ 163. com
测，均达到要求。辛芩颗粒（ 四川志远广和制药有限 公司，批号 110409） ，醋酸泼尼松片（ 广东华南药业集 团有限公司，批号 110604） ，盐酸西替利嗪片（ 成都恒 瑞制药有限公司，批号 110206） ，氨基已糖为 Sigma 公 司 产 品 （ 129K5008 ） ，Monclonal Anti-DNP，antibody produced in mouse 为 Sigma 公司产品（ D8406） ，DNP （ 7） -BSA 为 Bioseach technologies Inc 产 品 （ 02184102） ，大鼠组胺酶联免疫分析试剂盒（ Bio-Swamp，批号 ＲA20473） ，其他试剂为国产分析纯。 1. 2 动物 Wistar 大鼠，雌雄各半，体重（ 200 ± 20） g， 昆明种小鼠，雌雄各半，体重 18 ～ 22 g，SPF 级，均由南 方医科大学实验动物中心提供，动物合格证号 SCXK （ 粤） 2006-0015。动物适应性饲养 3 d 后，供试。 1. 3 细胞株 大鼠嗜碱性细胞白血病细胞株 ＲBL2 H3 ，购自中国 科 学 院 上 海 生 命 科 学 研 究 院 细 胞 资 源中心。 1. 4 仪器 Agilent G6410A QQQ LC-MS 液质联用 仪（ 美国 Agilent 公司） ，配有 Agilent 1200 液相色谱 系统，ESI（ 电喷雾电离源） 离子源，MassHunter 数据 工作站。CO2 培养箱 （ Thermo scientific） ； 倒置显微 镜（ optec 奥特光学 BDS200） ； 多功能酶标仪 （ ELX 8000） ； 纯水器（ Molecular） ； 800B 离心机（ 上海安亭 科 学 仪 器 厂 ） ； 低 温 冰 箱 （ 容 声 BCD-239TSC ） ； TD5A-WS 台式低速离心机（ 长沙湘仪离心机仪器有 限公司） ； 所用细胞培养瓶、培养板均为美国 Corning 公司产品。 2 方法 2. 1 麻黄附子细辛汤的制备 按麻黄-制附子-细
Key Lab of Traditional Chinese Medicine Preparations，Guangzhou 510515，China）
［Abstract］ To investigate the material basis of Mahuang Fuzi Xixin decoction（ MFXD） for anti-inflammation and immune-suppression based on the combined method of serum chemical and serum pharmacological. The LC-MS / MS fingerprints of MFXD，drug-containing serum and blank serum were compared to define the components in plasma. Histamine，β-hexosaminidase released from ＲBL-2H3 cell infulenced by drug-containing serum at different time points were measured by ELISA． The effect of drug-containing serum on lipopolysaccharide-induced splenocyte proliferation at different time points were determined by MTT. A correlation analysis was made on components of MFXD and pharmacological indexes based the stepwise regression method. After the intragastrical administration with MFXD，32 components were discovered in rat serum，including 27 prototype components （ 10 from Mahuang，13 from Fuzi and four
2015 年 5 月 第 40 卷第 10 期
Vol. 40，No． 10 May，2015
血清药物化学和血清药理学相结合的方法 探讨麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制的物质基础
唐锋，梁少瑜，陈飞龙，汤庆发，谭晓梅*
（ 南方医科大学 中医药学院 广东省中药制剂重点实验室，广东 广州 510515）
［摘要］ 利用中药血清药物化学及血清药理学相结合的方法探讨麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制的物质基础。通过比较麻 黄附子细辛汤、给药后含药血清和空白血清的 LC-MS / MS 图谱，寻找麻黄附子细辛汤的入血成分； ELISA 法测定各时间点含 药血清对抗原刺激 ＲBL-2H3 细胞释放组胺、氨基己糖苷酶的影响； MTT 法测定各时间点含药血清对脂多糖诱导小鼠脾细胞增 殖的影响； 采用逐步回归的方法对麻黄附子细辛汤的各成分与药理指标进行相关性分析。结果显示，灌胃给予麻黄附子细辛 汤后，从大鼠血清中发现 32 个成分，其中 27 个原型成分（ 10 个来自麻黄，13 个来自附子，4 个来自细辛） ，其他 5 个未知成分。 与空白血清相比，麻黄附子细辛汤各时间点含药血清均能降低抗原诱导 ＲBL-2H3 细胞释放组胺（ P ＜ 0. 05） ； 除麻黄附子细辛 汤 4 h 含药血清外，其余各时间点含药血清均能抑制抗原诱导的 ＲBL-2H3 细胞脱颗粒（ P ＜ 0. 05） ； 麻黄附子细辛汤 15，30 min 含药血清能显著抑制脂多糖诱导的小鼠脾细胞增殖（ P ＜ 0. 05） 。血中移行成分的化学数据和药理指标组胺释放量、β-氨基己 糖苷酶释放率以及脾细胞增殖抑制率进行回归分析，推测甲基伪麻黄碱、伪麻黄碱与抗原诱导 ＲBL-2H3 肥大细胞释放组胺密 切相关； 伪麻黄碱、次乌头原碱、甲基伪麻黄碱与抗原诱导 ＲBL-2H3 细胞释放 β-氨基己糖苷酶密切相关； 苯甲酰次乌头原碱、 苯甲酰乌头原碱、14-苯甲酰-10-羟基-中乌头原碱、新乌头原碱与脂多糖诱导小鼠脾细胞增殖抑制密切相关。由此可见，甲基 伪麻黄碱、伪麻黄碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、新乌头原碱等成分可能为麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制的部分 物质基础。 ［关键词］ 麻黄附子细辛汤； 血清药物化学； 血清药理学； 抗炎； 免疫抑制