叶绿素荧光原理

第一台高灵敏度荧光仪 ——Xe-PAM
¾藻类光合作用 ¾污染物检测 ¾9-AA荧光 ¾NADPH荧光 ¾UV吸收物质的测定 ¾Pump & probe法
光源为具“全光谱”的氙灯，结合滤光片可以选择性激发 藻类荧光，特制的激发-检测单元极大的提高了灵敏度
最畅销的荧光仪 ——PAM-2000/PAM-2100
• 1983年 Schreiber博士 PAM
Pulse-Amplitude-Modulation Chlorophyll Fluorometer
叶绿素荧光的产生
5000 μE/m²s
叶绿体
0.1 μE/m²s
100 μE/m²s
乙醇提取物
叶绿素荧光：
植物吸收的一小部分光重新以光的形式发射出来
(F) (D)
¾ 远红光（Far-red Radiation,FR）：是波长在735nm的远红 光，用来促进PS I活性，从而诱导PS II的PQ库迅速还原。
PAM结构示意图
饱和光
测量光
信号扩大器
长波截止滤光 片λ＜670 nm
光导纤维
反应杯
光电检测器
信号记录
光化光
远红光
短波截止滤光片 λ＞700 nm
MR
SR MR
• PAM荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光，包括 背景光很强时（调制技术）
• 光化学淬灭可以被一种短饱和脉冲光（0.2－1 s）暂 时完全抑制，剩余的荧光淬灭就是非光化学淬灭
PAM的测量原理
• 光源：测量光、光化光、饱和光、远红光
¾ 调制测量光（Mearsuring Radiation,MR）：是由发光 二极管产生的很弱的红光，其PFD＜0.2μmol·m-2·s-1， 波长为650 nm。在发光二极管与样品之间通常加有长波 截止滤光片（λ＜670 nm）.样品吸收光能后，部分激 发能以荧光的形式发出，通过探测器检测到。在探测器 和样品之间加有短波截止滤光片（λ＞700 nm）和吸热 滤光片。
photochemistry)，又叫原初光化学的最大产 量，PS II光化学反应的潜在产量，PS II潜在最 大量子产量等 。反映了当所有的PS II反应中心
均处于开放态时的量子产量 。
Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm ; 0＜Fv/Fm＜1 高等植物≈ 0.832±0.004 ; 藻类稍低
当植物或藻类受到胁迫（Stress）时，Fv/Fm 显著下降!
叶绿素荧光参数
• qP:光化学淬灭（ Photochemical quenching ） 即激发能被开放的反应中心捕
获并转化为化学能而导致的荧光淬灭，反映了光适 应状态下PS II进行光化学反应的能力。
qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’) ; 0≤qP＜1
叶绿素荧光参数
(P)
P+D+F=1
F = 1- P - D
光化学的 和 耗散性的 荧光 淬灭
活体叶绿素荧光是光合作用的有效探针
• 活体状态下，叶绿素荧光几乎全 部来源于PS II的Chl a（包括天线 Chl a），活体叶绿素荧光提供的 快速信息仅仅反映了PS II对激发 能的利用和耗散情况
• 光合作用过程的各个步骤密切偶 联，因此任何一步的变化都会影 响到PS II从而引起荧光变化，也 就是说通过叶绿素荧光几乎可以 探测所有光合作用过程的变化
产量，PS II能量转换的实际效率，PS II光化学的量子
效率，用于PS II光化学的能量占PS II天线系统吸收的
总光能的比例，以及PS II有效光化学量子产量
•
Φ
PS
II=(Fm’-Fs)/Fm’=ΔF/Fm’=qP·Fv’/Fm’
;
0≤ΦPS II ＜1
• 不需暗适应，不需测定Fo’，适合野外调查
饱和脉冲法
经验表明，只有PS II（不是PS I）的光化学与荧光发射呈竞争关系
短饱和脉冲光
PS II反应中心被暂时完全关闭
光化学淬灭全部被抑制
剩余的荧光淬灭即为非光化学淬灭
• E=P + D + F = 1 （能量守恒定律） • 打开饱和脉冲时：P=0, F=Fm, D=Dm, Dm=1－Fm • 假设在打开饱和脉冲的短暂时间内，D/F的比值保持
光合膜的 结构
① PS II ② Cytb6/f ③ PS I ④ ATPase
蓝藻 绿藻与高等植物
光合作用过程
光反应
暗反应
光合电子传递的”Z图”
叶绿素荧光基础
研究历史
• 1834年 Brewster • 1852年 Stokes教授 “fluorescence” • 1931年 Kautsky教授
PAM荧光仪 与饱和脉冲法
PAM——Pulse-Amplitude-Modulation “脉冲－振幅－调制”
至少含有一个很弱的调制测量光源和一个很强的非调制光 化光源。 当只照射调制测量光时，只能引起相当于Fo的荧光 ，开 启成强。光由化于光锁后相才放能大诱器导的Q作A－用的，积得累以和放荧大光的诱信导号动只力是学和的调形制 光同频率的荧光发射信号，而且二者之间有一定的相位 差，因而对各种非相关光线的干扰有很强的排除和抑制的 能力 当两光源同时开启时，作用光激发反应中心引起调制荧光 的改变，信号经放大器放大，产生可变荧光。光化光本身 包含的与荧光相同波长的光成分由于与调制频率相差甚 远，不会影响检测
叶绿素荧光参数
• Fv’/Fm’: PS II光化学的有效量子 产量 （Effective quantum yield of PS II photochemistry）
• Fv’/Fm’ =(Fm’-Fo’)/Fm’ =1-Fo’/Fm’ ; 0＜ Fv’/Fm’ ＜1
• 由于在光适应状态下非光化学过程得 到活化，因此Fv’/Fm’往往小于Fv/Fm
叶绿素荧光参数
•
Φ
PS
II:
PS
II光化学能量转换的有效量子产量
（Effective quantum yield of photochemical
energy conversion in PS II）也叫PS II（线性）
电子传递的实际量子产量，PS II复合体吸收的每个光量
子引起电子传递的效率，PS II光化学能量转换的总量子
Fv’ 任意光适应状态下的最大可变荧光，Fv’=Fm’-Fo’
Fs 稳态荧光产量，当外界条件保持恒定时，照射光化光后达稳定值时的 荧光产量（qP＞0，qN＞0）
叶绿素荧光参数
Fv/Fm,
qP,
qN,
NPQ,
Fv’/Fm’,
Φ PS
II,
ETR等
• Fv/Fm: PS II的最大光化学量子产量
(Maximum quantum yield of PS II
¾ 饱和光（Saturation Radiation,SR）：光源为可以发出强白光 的卤钨灯（PFD可以达到10000 μmol·m-2·s-1）。加上SR后， 所有的PS II反应中心被暂时完全还原（关闭），无任何光化 学过程（kp＝0），于是吸收的光能全部被转化为荧光和热 能，得到Fm。在加SR时，为得到较高的信号/噪声比，一般将 MR的频率调高。
Fo
Fm
LHC
LHC
光化学
光合
RC
作用
光化学
光合
RC
打
作用
热
12
热 断！
AR MR
3
4 AR
SR
MR
F
LHC
光化学
光合
RC
作用
热
Fm’
LHC
光化学
光合
RC
打
作用
热 断！
叶绿素荧光诱导动力学曲线
peak
inflection(inter mediate) peak
a maximum
terminal steady state
2004-12-2
2
• 不仅仅是一个……产品的平台 不仅仅是一个……技术的平台 不仅仅是一个……服务的平台 不仅仅是一个……资源的平台 不仅仅是一个……应用的平台 不仅仅是一个……
• 中国生态仪器网……网上生理生态技术交流中心，期待您 的参与！
• 网络由主要由AndyZhang负责技术维护,若您有意主持栏目或有什么建 议，请联系：WALZ@zealquest.com 张聪
¾野外光合作用 ¾生态生理学 ¾胁迫生理学 ¾环境污染物对植物
• 泽泉科技有限公司 • 中国 上海市定西路710弄16号鸿申大厦24楼A座
• 邮编：200052
• 电话：021-62837346，62837347，62837349，62838513
• 传真：021-62838512 sales@zealquest.com
2004-12-2
3
光系统与光合作用 基本过程
dip origin
quasi-steady state
PAM测量的荧光曲线——饱和脉冲法
SP
叶绿素荧光术语
术语
意义
Fo 初始荧光，也称基础荧光，是在暗适应状态下当PS II的所有反应中心 处于完全开放状态（qP=1）并且所有的非光化学过程处于最小时 (qN=0)的荧光产量
Fm 最大荧光，是在暗适应状态下当PS II的所有反应中心处于完全关闭状 态(qP=0)并且所有的非光化学过程处于最小时(qN=0)的荧光产量
Fv 暗适应状态下当所有的非光化学过程处于最小时的最大可变荧光， Fv=Fm-Fo
Fp 暗适应状态下打开光化光后的最大荧光产量（Kautsky曲线中的P点)
Fm’ 在光适应状态下当PS II的所有反应中心处于关闭态（qP=0）并且所有 的非光化学过程处于最优态时（qN＞0）的荧光产量
Fo’ 在光适应状态下当PS II的所有反应中心处于开放态（qP=1）并且所有 的非光化学过程处于最优态时（qN＞0）的荧光产量。
耗散性的荧光淬灭通常称为非光化学淬灭 (Non-Photochemical Quenching)，也称非辐 射能量耗散，也就是指热耗散
非光化学淬灭是过剩光能（有害）耗散为热 （无害）的有效探针
荧光产量与饱和脉冲法
• 任一状态下的荧光产量是将最大荧光（Fm）淬灭 （光化学、非光化学）的结果
• Fm是指在非光化学淬灭最小（qN＝0）的状态下 （通常指暗适应状态）的荧光
不变，则 D/F=Dm/Fm
D=F • Dm/Fm=F • (1－Fm)/Fm 因此，PS II的量子产量P可根据下式计算
P=1－F－D=1－F • (1－Fm)/Fm=(Fm－F)/Fm=ΔF/Fm
暗适应：Fv/Fm 光适应：ΔF/Fm
光化学能量转换引起的荧光淬灭通常称为光 化学淬灭（Photochemical Quenching）
•非光化学淬灭（ Non-photochemical quenching ）： qN or NPQ
• qN: 可变Chl荧光的非光化学淬灭 qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo); 0≤qN≤1
• NPQ: Chl荧光的非光化学淬灭 NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1; 0≤NPQ＜+∞ 不需测定Fo’，适合野外调查
叶绿素荧光原理 与PAM荧光仪的应用
韩志国 韩博平
暨南大学水生生物研究所
• 中国生态仪器网是泽泉科技主办的网上生理生 态仪器与应用信息交流中心,在这里您可以交流 各种生理生态方面的技术，产品与应用信息
• 多位国内外优秀专家学者,多位泽泉科技的技术 工程师,以及德国WALZ等国外厂商的技术人员 分别主持各个栏目，希望能够共同建立一个交 流的平台
同时记录荧光诱导曲线与光合放氧
光响应曲线
丰富多彩的PAM荧光仪
全世界第一台PAM荧光仪 ——PAM-101/102/103
¾光合作用 ¾胁迫生理学 ¾环境污染物对植物的影响 ¾浮游植物研究 ¾P700测定
研究对象以高等植物为主，兼顾藻类，至今仍是最经 典的型号，目前只有它能测定PS I（P700）的变化
叶绿素荧光参数
• rETR: 相对电子传递速率
（relative electron trHale Waihona Puke Baidunsport rate） • ETR=PAR·ΦPS II·0.84·0.5 • ETR随PAR的变化图即为光响应曲线
PAM荧光仪的实际应用
Calvin循环可以通过荧光淬灭来分析
热胁对Calvin循环的影响可以通过荧 光淬灭反映出来
¾ 光化光（Actinic Radiation,AR）: 由一系列的二极管产生的波 长在665 nm的红光，其PFD一般为几百μmol·m-2·s-1。若采用 蓝色（λ＝450 nm）的AR，则Chl分子被激发到第二激发 态。现在有多种光化光源（红色，蓝色，绿色，白色）可被用 来诱导Chl荧光。 Chl荧光的变化可以作为MR诱导的脉冲信号 的振幅调制而被检测到 。采用高选择性的放大系统可以避免 非荧光信号的干扰。部分激发光会被样品反射或透射，反射光 可被短波截止滤光片滤掉。