蛋白质氧化性损伤与疾病研究进展

作者单位3兰州医学院生物化学与分子生物学教研室综述

蛋白质氧化性损伤与疾病研究进展

郝春燕　苏海翔综述　姚侃审校

【摘要】　由活性氧引起的蛋白质氧化性损伤与衰老、肿瘤、糖尿病及许多神经退行性疾病的发生相关。蛋白质羰基是目前应用最多的蛋白质氧化性损伤的标志物,体内羰基水平的改变可以反映蛋白质氧化损伤的程度。

【关键词】　自由基;　蛋白质氧化;　羰基

由自由基介导的蛋白质氧化产物作为体内氧化性损伤的特异性标志物,是近几年自由基生物学研究的热点之一。在细胞内、外环境中,蛋白质都是自由基和其他氧化剂作用的主要目标。据估计,细胞内的大分子中,由蛋白质清除的自由基占活性自由基总量的50%～75%。由于某些蛋白质具有较长的半衰期,容易造成氧化性损伤的积累,因此蛋白质氧化性损伤的形成可能是哺乳动物氧化性损伤的高度敏感指标。

引起蛋白质氧化损伤的因素

活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(react ive nit r ogen species,RNS)是引起蛋白质氧化损伤的重要因素。ROS主要包括O÷2与O H及其活性衍生物如H2O2、HOCl、1O2、LO、LOO及LOO H等。而RNS主要指含氮自由基及其衍生物,如NO、ONOO÷及ONOOH。ROS和RNS可以通过多种代谢途径产生,如化学毒物与药物代谢、细胞呼吸、辐射、光照等。ROS/RNS具有较高的反应活性,很容易快速与细胞内的大分子物质反应,引起与许多病理过程有关的细胞结构的广泛损伤,如膜脂质过氧化、蛋白质及核酸等的氧化损伤。目前的研究表明,由ROS/RNS引起的蛋白质氧化性损伤与衰老及阿尔茨海默症(alzheimer di sease,AD)、帕金森氏病(parkins on disease,PD)等神经退行性疾病的发生有关。

蛋白质氧化产物的形成

1.蛋白质主链的氧化:蛋白质和肽可以与多种自由基反应引起主链和侧链的改变。蛋白质主链断裂可以通过SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodi um dodec2 ylsulfatepo2l yacry2lamide gel elect rophoresis,SDS2 PA GE)或高效液相色谱(high2power liquid chromato2 graphy,HPL C)被迅速检测。但由于生物系统中多种蛋白质的存在以及蛋白酶体的潜在水解修复作用,因此在完整的生物体系中,主链断裂产生的片段几乎不能用来作为蛋白质氧化性损伤的标志物。

2.蛋白质侧链的氧化:(1)脂肪族氨基酸侧链的氧化:自由基和侧链残基反应可以产生多种产物。在O

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存在时,羟自由基及其他自由基都可以氧化蛋白质的脂肪族侧链,形成氢过氧化物、羟基衍生物和羰基复合物。羟基衍生物比较稳定,不易进一步氧化,其中许多已经作为蛋白质氧化的标志物,如3、4、52 OH亮氨酸,32OH2缬氨酸等[1]。蛋白质的羰基衍生物是侧链赖氨酸、脯氨酸、精氨酸等通过大量的烷氧自由基和过氧自由基反应形成的,羰基及其衍生物的存在已经被作为由ROS介导的重要的蛋白质氧化标志物。(2)芳香族与杂环氨基酸残基的氧化:芳香族与杂环氨基酸中的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸等侧链也很容易被氧化。自由基进攻的主要位点是这些氨基酸残基的芳香环或杂环,结果导致环的氧化或断裂,形成不同的氧化产物。经活性氧作用后,苯丙氨酸可以转变为2,32(OH)22苯丙氨酸。酪氨酸可以形成3,42(OH)22苯丙氨酸、邻位和间位酪氨酸、二聚酪氨酸、32硝基酪氨酸及32氯酪氨酸等。32硝基酪氨酸可进一步与氧化剂反应生成3,52二硝基酪氨酸。色氨酸可以被迅速氧化形成2、4、5、6、7位羟化的色氨酸及开环物,如N2甲酰犬尿氨酸、32O H2犬尿氨酸、犬尿氨酸和其他氧化产物。这些产物的复杂性及其不稳定性,使得它们很难作为定量的标志物。组氨酸可以被氧化成22O2组氨酸,是唯一被用作组氨酸氧化的标志物。(3)含硫氨基酸残基的氧化:半胱氨酸和蛋氨酸对几乎所有ROS都特别敏感。即使在比较温和的条件下,半胱氨酸也可以氧化形成二硫化物,蛋氨酸残基可以氧化为蛋氨酸亚砜残基。尽管半胱氨酸、蛋氨酸残基很容易被氧化,但由于生物体系中含有二硫化物还原酶和蛋氨酸还原酶,可以还原氧化型半胱氨酸和蛋氨酸,使损伤得以修复。因此,半胱氨酸和蛋氨酸的氧化产物不能作为理想的蛋白质氧化性损伤的标志物。同时,修复酶体系活性的高低对氧化损伤水平也有显著影响,特别是在慢性低水平氧应激时,修复过程可以和损伤过程进行竞争,在评价氧化损伤的程度时容易产生错误的结论[]。

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蛋白质氧化产物的测定

蛋白质羰基是目前应用最多的蛋白质氧化性损伤标志物,可以通过许多不同方法进行分析[2,3]。目前已有许多方法可以在体外分析蛋白质中总蛋白质羰基的含量。这些分析的基本原理是:利用2,42二硝基苯肼与羰基化的蛋白质反应,形成稳定的2,42二硝基苯腙(2,42di nit rophenylhydrazine,2,42DNP)衍生物。然后采用紫外分光光度法、HPLC或质谱检测。也可用抗22,42DNP抗体,利用West ern印迹、免疫组化及EL ISA法检测。HPLC和质谱法可同时检测多种氧化性损伤产物,但是在样品预处理过程中容易造成人为的氧化损伤,并且对实验设备的要求较高,不适合在一般实验室开展。EL ISA法可以检测到微克水平蛋白中的羰基,它是利用链霉抗生物素2辣根过氧化物酶标记的抗DNP的抗体来检测羰基化的蛋白与2,42二硝基苯肼反应后生成的2,42DN P。该方法具有很高的灵敏度,并且只要有酶标仪就可完成检测,适合开展临床检验。

酪氨酸残基氧化产物也是目前研究较多的氧化损伤指标,其中32硝基酪氨酸和硝基化的超氧化物歧化酶(superoxide dismut ase,SOD)是较常见的检测指标。此外,还有邻位和间位酪氨酸及32氯酪氨酸等。32硝基酪氨酸多采用免疫组织化学的方法检测,也可以利用HPLC和质谱联用进行检测[4]。硝基化的SOD也多采用免疫组织化学法来检测。邻位和间位酪氨酸及32氯酪氨酸可以用气相色谱/质谱联用(gas chromatography/mass spect romet ry,G C/MS)进行检测。GS/MS是用一个与待分析物结构相似的稳定的同位素作内标(i nternal st andard),在抽提、样品处理及色谱分析过程中,内标的行为与待分析物相似,可以提高定量测定的精确性。G C/MS法可以在复杂的混合物中准确定量痕量的待分析物,是一种特异、敏感和精确定量蛋白质氧化损伤产物的方法[5]。

此外,还可以用HPLC技术检测OH进攻苯丙氨酸的产物及组氨酸氧化的标志物———22氧2组氨酸。

氧化性蛋白质与衰老和疾病

1.蛋白质氧化与衰老:动物实验表明[6],在氧应激时,与幼年动物相比,老年动物对蛋白质的损伤更敏感,并且动物暴露于氧应激状态时所导致的酶的改变与衰老时的变化相似。如在小鼠体内,血浆总蛋白质羰基的含量随着年龄的升高而明显升高。在培养的人成纤维细胞中,随着成纤维细胞供体年龄的增加,蛋白质羰基含量呈指数增加。而在人的脑组织、晶体及红细胞中,蛋白质羰基含量的增加也与年龄相关。提示衰老过程与蛋白质氧化有关。

2.蛋白质氧化与疾病:蛋白质氧化损伤与许多疾病相关,包括D、D、糖尿病、慢性肾衰、先兆子痫、严重感染等。()蛋白质氧化与神经退行性疾病D 是最常见的神经退行性疾病,主要临床表现为进行性记忆丧失和痴呆。大量研究表明,D的发生与氧化应激有关。对AD患者的研究发现,其海马回和海马旁回组织切片中氧化性蛋白的水平升高[7];也有报告AD患者脑组织羰基还原酶的水平升高。羰基还原酶可以使具有细胞毒性的羰基被还原而解毒,该酶水平升高可能与蛋白质羰基化水平升高,从而诱导酶的生成增加有关[8]。对AD患者的尸体解剖发现,其脑组织与脑脊液中32硝基酪氨酸水平较相应的对照组分别升高5～8倍和6倍,并且其脑脊液中硝基化Mn2 SOD水平升高,而线粒体蛋白中Mn2SOD的硝基化可以使该酶失活,从而导致其清除自由基的能力降低[4]。此外,有人发现,和正常对照相比,AD患者血浆中总氧化蛋白的水平升高,并且通过Western印迹显示,血浆蛋白中被氧化的蛋白在电泳时只出现一条带,而这种蛋白在体外对氧化修饰更敏感,提示该种蛋白可能是一个特异的蛋白质氧化损伤的指标[9]。K orolainen MA等[10]的研究则认为,AD患者体内的蛋白质氧化和降解之间的平衡发生了改变。以上证据都提示,蛋白质羰基的形成可能参与了AD的发生。PD也是较常见的神经退行性疾病,以进行性运动障碍为主要临床表现。研究发现,PD患者脑黑质、基底神经节、苍白球、额部皮质、小脑等脑部组织中蛋白质羰基水平均升高,并且通过免疫组化染色发现患者脑脊液中硝化的SOD水平明显升高[4],这提示蛋白质氧化损伤与PD的发生有关。(2)蛋白质氧化与慢性肾功能衰竭和透析治疗:大量研究表明,慢性肾功能衰竭与氧化应激有关,近期的研究还发现,慢性肾功能衰竭患者的透析治疗也可能影响患者的氧化应激。对慢性肾功能衰竭患者和健康志愿者的研究表明,慢性肾功能衰竭患者血浆中总蛋白羰基的水平高于健康对照组;采用Western印迹进一步分析发现,与健康对照相比,慢性肾衰患者血浆中的血清蛋白更容易被氧化[11],提示不同的蛋白质对氧化损伤的敏感性可能有差异。对慢性肾衰患者采用透析治疗的研究发现,血液透析、腹膜透析和未采用透析治疗的慢性肾衰患者血浆中蛋白质羰基水平依次降低,即采用血液透析者高于腹膜透析者,后者又高于未用透析者[12];近期的研究也表明,血液透析过程中患者机体的抗氧化能力降低,氧化性蛋白和脂类的水平均升高[13],这也可能是经血液透析后血清脂类和蛋白质对氧化性修饰的敏感性增加所致。(3)蛋白质氧化与其他疾病:Zusterzeel PL等[14]对孕妇的观察发现,孕妇血浆中蛋白质羰基水平明显高于未怀孕的妇女,提示怀孕时可能处于一定程度的氧化应激状态。此外,还发现先兆子痫的孕妇血浆中蛋白质羰基水平也明显高于健康孕妇,提示该病的发生可能与蛋白质氧化损伤有关。近期的研究还发现:先兆子痫伴有溶血、肝酶升高和低血小板综合征的患者,蜕膜和胎盘组织中蛋白质羰基含量较健康孕妇明显升高,并且血浆总抗氧化能力也降低,这说明由ROS介导的损伤可能参与了这种疾病的发生[5]。

此外,研究还发现,类风湿性关节炎患儿血浆中蛋白质羰基水平较健康儿童升高;并且处于疾病活动

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